兔VX2肝癌模型的建立的綜述
引言
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命健康，而是否存在轉移是決定患者存活期和腫瘤治療成敗的主要因素。肝臟是惡性腫瘤最常見的轉移部位，據1915~1973年的屍檢統計，因惡性腫瘤而死亡的病人中，有24%~36%的病人發現肝轉移。Weiss等指出，其中結腸、直腸癌患者有20%將死於肝轉移。因此，早期發現肝癌對腫瘤診治至關重要，可爭取手術機會，明顯延長患者生命。為了進一步探討肝臟腫瘤的影像學特徵，需要建立一個類似人肝癌的動物模型，以期對其進行深入的基礎研究和臨床研究，可以預見這樣的動物模型對探討腫瘤複發轉移機制、病理演變過程、早期診斷、治療等方面的研究均具有重要價值。
而這方面的實驗研究則要求採用較大的動物模型才更為合適。目前在較大動物建立的肝癌模型的報道尚少，兔肝VX2 癌是少數建立在較大動物的肝癌複發轉移模型，是目前用於影像研究最為理想的肝癌實驗模型之一。近年來已有學者將其用於介入、高強度聚焦超聲、微波治療、新型肝臟特異性和血池型CT、MRI造影劑等的實驗研究，是目前用於影像研究最為理想的肝癌實驗模型之一。能過建立兔VX2 肝癌模型，利用影像設備監測兔VX2 肝癌的生長、轉移情況，並將兔VX2 肝癌各階段的MRI影像學表現與病理切片進行比較研究，促進人早期肝癌的診斷與治療。
1 VX2 瘤株簡介
在1930年後期，Kidd利用Shope病毒在兔子體內誘髮XX瘤，隨後轉化成鱗狀細胞癌，建立了可以植入兔子的許多部位和器官的VX2 瘤種，從而成功地建立了兔子VX2 腫瘤動物模型。實驗所用瘤株來源於Shope病毒致XX瘤惡變形成的上皮細胞惡性腫瘤，經過72次傳代后正式建株，並可接種到兔肝臟、腎臟、肌肉、肺臟等部位，製成原位腫瘤動物模型。
實驗一般採取兔VX2 腫瘤模型的主要原因是：該腫瘤性質穩定，增殖迅速，短期內即可發生廣泛壞死，並形成肝、肺轉移，故VX2 腫瘤瘤株在大型動物模型的研究上具有很高的應用價值。
2 動物模型的特點
兔腫瘤模型具有製作簡便易行，價格相對低廉，實驗周期短、成功率高、重複性好、模型性質穩定等特點。兔肝髒的左葉體積明顯大於右葉，左肝動脈較粗大，大多數從腹腔動脈直接發出，而右肝動脈較細。同時為了方便操作，避免栓塞材料等XX膽囊動脈引起不必要的併發症。因此，研究VX2 肝癌模型最好是將懸液種植于肝左葉。雖其組織形態，生物學特性與原發性肝癌有所不同，而兔長期生存率不高，且兔VX2 肝癌模型在短期內即出現明顯的液化壞死等均不利於長期研究，但可用作有關肝癌治療學及肝癌影像學等的相關臨床前期研究。
3 VX2 瘤株的製備
首先，將VX2 冰凍腫瘤細胞按一般細胞培養技術進行復甦后8004/min離心5min，棄去上清液，加入PBS液再離心5min，再棄上清液后加入PBS液並用玻璃棒攪勻。取懸液置於培養皿中培養傳代，台盼藍染色，將培養液調製成1×107/ml活細胞密度。取0.5ml接種于兔後腿外側肌肉內，2周后可捫后及後腿外側肌肉內一實質性包塊，說明荷瘤兔製作成功。傳代一般在2~4周左右進行，4周后瘤體多液化壞死，影響接種質量。在無菌條件下將兔全麻後手術剝離荷瘤兔腿肌肉腫塊，切開瘤體后取瘤細胞生長活躍的灰白色魚肉樣組織置於盛有生理鹽水(青黴素40萬U)4 燒瓶中，剔除壞死組織及纖維組織，以便製成腫瘤懸液。用1ml注XX器抽取1ml備用。當採用腫瘤組織塊直接接種法時則將荷瘤兔體內取出的生長活躍的腫瘤組織用手術剪剪碎至1~2mm3的小塊以便後續種植之用。
4 兔VX2 肝癌模型的建立
目前兔VX2 肝癌模型的建立主要有3種方法：瘤細胞懸液經肝包膜注入法、超聲穿刺接種，腫瘤組織塊直接接種法。
4.1 腫瘤組織塊直接接各法
將免子全麻后無菌條件下逐層開腹，暴露肝臟，以眼科鑷于肝左葉中央比較厚處刺存肝組織並形成口小高爾夫球大的「燒瓶」樣竇道，將2~3塊剪碎的瘤株植入其中，並以明膠海棉碎塊埋塞竇口。確認止血后回納肝臟，逐層關腹。術中還應注意：(1)瘤析製備時要將壞死組織及纖維組織剔除乾淨，以免影響成功率。(2)注意無菌操作，避免感染所所致接種失敗。(3)塞入瘤株碎塊后，應以明膠海綿填塞竇口，一來可避免瘤塊溢出造成腹腔種植;二則可使瘤株盡可能種植在肝左葉深部，可使瘤灶靠近較大血管支易於獲得血供。
4.2 超聲穿刺接種
常規肋下B超或CT掃查待接種兔肝臟，明確兔肝位置並確定待接種部位，選定穿刺點、角度、深度。常規消毒鋪巾，尖刀挑開穿刺點皮膚(術后瘢痕點可作作為B超或CT監測移植瘤的部位)，用帶尖頭穿刺針芯穿刺針沿設定的穿刺角度、方向穿入預定肝位置，助手固定好穿刺針，術者拔出針芯，眼科鑷夾1塊瘤塊放入針鞘內，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝幾，重複1~2次。在直視下來回在針鞘內推動平頭穿刺針芯，證實瘤塊接種于肝臟。如未成功，可再重複上述操作。術后連續3天青黴素40萬U+慶大霉素4萬U肌注。採用直接穿刺法複製出的VX2 兔肝癌模型具有方法簡單、成功率高、模型性質穩定的特點。
同常規開腹接種法相比具有以下優點：不需開腹，無開腹接種法常伴的出血多、損傷大、術中兔麻醉過淺不易操作，麻醉過深易致意外死亡;術後手術瘢痕影響超聲監測等缺點。同懸液注XX法相比：形成的腫瘤為孤立結節型而非瀰漫性腫瘤，便於進行肝癌的影像學研究，無腹腔種植，並且可根據研究需要調整模型腫瘤在肝的位置。不過，由於兔肝小移動性大且分葉多，故在選兔時一般選擇體型較大的兔，為提高穿刺接種成功率，要長度略長於外套針;穿刺時需一定的技巧;先用尖刀挑開擬穿刺處皮膚，再進針。進針要求快，防止瘤塊接種于肝葉之間的空隙中。