5+！！二次聚類聯合通路相關基因構建胃癌預后模型
原文轉自：一起實驗網
更多醫學生信思路獲取請戳https://www.yiqishengxin.com/
老師們上午好！今天為大家分享一篇22年11月分享在Frontiersin Pharmacology (IF: 5.988)雜誌的文章。本文基於TGF-β信號通路相關基因對胃癌患者進行了二次聚類，並構建了TGF-β相關預后模型，建立風險評分。分析高、低風險組的預后、腫瘤突變負擔(TMB)、腫瘤微環境（TME）、對免疫檢查點抑製劑(ICIs)和抗腫瘤藥物的敏感性等。對於該思路有興趣的老師，可以與我們聯繫，方法和思路適用於其他疾病。
背景：目前，大多數研究只關注TGF-β信號通路中的一兩個基因，而腫瘤的發生往往是大量基因相互作用的結果。因此，有必要系統分析TGF-β信號通路中多個基因與TME的關係，以發現新的、不同的免疫表型，篩選對免疫治療敏感的人群，進行更精準的治療。TGF-β信號通路在腫瘤進展和免疫反應中起著至關重要的作用。然而，TGF-β信號通路相關基因（TSRG）與胃癌臨床預后、腫瘤微環境（TME）和免疫治療之間的聯繫尚不清楚。
方法：1.通過TCGA和GEO資料庫下載胃癌的轉錄組數據和相關臨床數據，從MSigDB獲得54個TSRG；
2. 基於TSRGs進行第一次聚類，將患者分成2個cluster，並分析了不同分子亞型在預后、臨床病理特徵和TME方面的差異；再基於2個亞型的差異表達基因（DEGs）進行第二次聚類，將患者分成3個不同的cluster。
3. 使用單變數和最小絕對收縮和選擇運算符（LASSO）Cox回歸分析構建TGF-β相關預后模型，以量化每位患者的風險程度。根據中位風險評分將患者分為高風險和低風險兩組。
4. 對高危和低危組患者對免疫檢查點抑製劑（ICIs）和抗腫瘤藥物的敏感性進行分析。
技術路線圖：
研究結果1.TSRGs在胃癌中的差異表達和遺傳變異景觀
對54種TSRGs在胃癌組織中的差異表達進行分析，得到了43個DEGs，其中JUNB、ID1等5個基因在胃癌組織中低表達，其餘DEGs高表達(圖1A)。基於String資料庫構建了蛋白-蛋白相互作用網路(圖1B)。接下來，探討了胃癌患者54個TSRGs的體細胞突變水平和CNVs改變頻率。
2.基於TSRGs進行第一次聚類，將胃癌患者分成2個亞群
基於54種TSRGs的表達水平進行了無監督聚類分析，以確定胃癌亞型：TGF-βclusterA和TGF-βclusterB。Kaplan-Meier生存分析顯示TGF-βclusterB具有更顯著的生存優勢。另外，結合TGF-β亞群和胃癌患者的臨床病理特徵繪製了54個TSRGs表達熱圖，TGF-βclusterA中的表達水平更高(圖2F)。
3.兩種不同TGF-β亞群的TME特徵
ESTIMATE分析顯示，TGF-βclusterA組患者基質評分、免疫評分和ESTIMATE評分較高(圖3A-C)。TGF-βclusterA組患者的PD1、PD-L1和CTLA4表達水平更高(圖3D-F)。使用CIBERSORT演算法進一步分析了兩種TGF-β亞組的免疫細胞浸潤水平。此外，GSVA富集分析顯示TGF-βclusterA中富集了多種腫瘤相關信號通路(圖3H)。
4.基於TGF-β亞群相關DEGs進行二次聚類
分析TGF-βcluster相關的DEGs，並進行了功能富集分析（GO和KEGG）(圖4A-B)。然後，通過單因素Cox回歸分析，篩選出了199個與胃癌患者預后相關的基因。基於199個基因的表達水平，採用無監督一致性聚類分析將胃癌患者分為三個不同的基因簇，即geneclusterA、geneclusterB和geneclusterC(圖4C-D)。分析三組患者的生存期和差異表達基因(圖4E)。
5.構建預后風險模型並驗證
採用LASSO和多因素Cox回歸分析構建基於5個基因的風險模型，計算每位患者的風險評分(圖5A-C)。桑基圖顯示了風險評分與TGF-β簇、基因簇、生存狀態之間的相關性(圖5D)。不同TGF-β聚類與基因聚類間的風險評分存在明顯差異(圖5E-F)。
6.TGF-β聚類相關DEGs預后模型的預后價值
根據中位風險評分將胃癌患者分為高風險組和低風險組。並繪製風險評分曲線和生存狀態散點圖（圖6A-B)和Kaplan-Meier生存分析（圖6C)。風險評分的1年、3年和5年AUC值分別為0.612、0.668和0.694（圖6D)。並在兩個驗證集中進行了相同的分析並獲得了相同的結果（圖6E–L證明我們建立的風險模型在預測胃癌患者的生存結果方面具有出色的表現。
7.基於預后模型的臨床特徵和生存分析
為探索風險評分與可用臨床病理特徵之間的相關性，分析臨床亞組之間風險評分的差異。結果顯示，不同年齡組和性別亞組的風險評分無顯著差異（圖7A-B），而T3-4和N1-3亞組的患者風險評分較高（圖7C-D)。此外，對不同的亞組進行了Kaplan-Meier生存分析。結果發現，在年齡、性別、T3-4、N1-3亞組中，高危組患者的OS顯著低於低危患者（圖7E-H、圖7L），而T1-2、N0亞組患者OS無明顯差異（圖7I-K）。
8.風險評分與臨床特徵的獨立預后
為探索風險評分是否是胃癌患者的獨立預后因素，結合臨床病理學特徵，在訓練集和兩個驗證集（測試集和整個集）中進行了單變數和多變數Cox回歸分析（圖8A-F）
9.列線圖的構建和驗證
鑒於胃癌患者的風險評分與預后密切相關，繪製了性別、年齡、T分期、N分期和風險評分的列線圖，以預測訓練集和兩個驗證集中患者1年、3年和5年生存率（圖9A、C、E)，並繪製了相應的校準曲線（圖9B、D、F)。
10.腫瘤免疫微環境
ESTIMATE分析胃癌高危人群和低危人群在腫瘤免疫微環境的差異的結果：高危組胃部患者基質評分、免疫評分、ESTIMATE評分較高（圖10A)。隨後，使用七種演算法來評估免疫細胞浸潤水平與風險評分之間的相關性（圖10B-C)。並使用ssGSEA進一步探索了兩個亞組之間16個免疫細胞和13個免疫相關途徑的差異（圖10D-E)。最後，分析了兩個亞組之間免疫檢查點相關基因的表達水平
11.免疫治療應答率分析
TMB與風險評分之間的相關性分析結果顯示：TMB與風險評分呈負相關（圖11A），低危組胃癌患者的TMB顯著高於高危組胃癌患者（圖11B)。Kaplan-Meier生存分析顯示，風險評分降低了高TMB組胃癌患者的預后優勢（圖11C)。對胃癌患者的體細胞突變分析結果展示最常見的突變形式和前5名突變基因（圖11D）。此外，分析了MSI與風險評分之間的相關性，並表明低風險組患者的MSI-H比例較高，MSI-H患者的風險評分較低（圖11E)。
12.藥物敏感性分析
為探索風險模型在臨床治療中的潛在作用，分析了常見抗腫瘤藥物在高低風險組之間的IC50差異。結果發現：低危組患者對ATRA、阿糖胞苷等藥物更敏感，而高危組患者對阿昔替尼、博來霉素等藥物更敏感（圖12)。以上結果表明，我們的預后模型可以作為胃癌患者抗腫瘤藥物的重要指標