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白念珠菌粘附素的分離純化及其在介導與宿主細胞粘附中的作用

来源:www.uuuwell.com  2015-12-15 23:00

   

念珠菌粘附素的分離純化及其在介導宿主細胞粘附中的作用

中華皮膚科雜誌 1998年第5期第31卷 論 著

作者:劉曉紅 廖萬清 胡惠民 姚志榮 王君松 趙子卿

單位:271000泰安,濟南軍區第八十八醫院皮膚科(劉曉紅 王君松 趙子卿);第二軍醫大學附屬長征醫院(廖萬清 姚志榮);第二軍醫大學生化教研室(胡惠民)

  【摘要】 目的 從分子水平探討白念珠菌(簡稱白念)與宿主細胞的粘附機制。方法和結果 用非離子去垢劑辛基吡喃葡萄糖苷提取白念孢子壁蛋白質,然後製備纖連蛋白Sepharose 4B親和柱,運用親和層析技術從上述提取液中分離純化纖連蛋白粘附素,在非還原狀態進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),得到表觀分子量60 000和105 000的二條蛋白帶。為了弄清此蛋白在白念與宿主細胞粘附中的作用,把人頰粘膜上皮細胞與白念孢子共同振蕩孵育2小時,顯微鏡下測定上皮細胞表面粘附白念的數目,白念與上皮細胞的粘附百分率為44.7±6.28,上皮細胞經纖連蛋白粘附素預處理后,粘附百分率為28.3±6.18,P<0.01。結論 纖連蛋白粘附素介導了人頰粘膜上皮細胞與白念的粘附。

  Isolation and Purification of Adhesin of Candida Albican s and its Effect on Adherence to Host Cells  Liu Xiaohong, Lia o Wangqing, Hu Huiming, et al. Department of Dermatology, Eighty-eighth Hospita l of Jinan Military Area Command, Taian 271000

  【Abstract】 Objective To investigate the adherence mecha nism of Candida albicans to host cells in molecular level.Methods and Results Yeast cell wall protein of Candida albicans we re extracted, and purified fibronectin (Fn) adhesin was obtained from yeast cell wall extract. Fn adhesin was anal yzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular weights of Fn adhesin were 60kd and 105kd. In order to find out t he effect of the protein on adherence to host cells, human buccal epithelial cells and Candida albicans cells we re i ncubated at 37℃ for 2 hours on a rotator, and yeasts adhering to the surfaces o f epithelial cells were assayed microscopically. The adherence rate of C .albicans to buccal epithelial cells was 44.7±6.28%, and after treati n g the epithelial cells with Fn adhesin, the adherence rate reduced to 28.3±6. 18%, P<0.01.Conclusion T he results indicate Fn adhesin could mediate adherence of Candida albic ans to epithelial cells.

  【Key words】 Candida albicans Fibronectin Adhere

  白念珠菌(白念)是重要的條件致病菌,可侵犯皮膚、粘膜和內臟。研究表明白念與宿主細胞間的粘附是其侵入宿主引起感染的前提,在介導白念與宿主細胞的粘附中,纖連蛋白(Fn)起了重要作用[1]。我們運用Fn做親和配體,用親和層析技術從白念孢子壁蛋白提取液中成功地分離純化了Fn粘附素,而且驗證了其能介導人頰粘膜上皮細胞與白念的粘附。

  材料和方法

  一、材料

  1.白念為長征醫院皮膚科中國醫學真菌保藏管理中心提供,為臨床分離的菌株D67,血清型A型。

  2.試劑來源:Fn、溴化氰活化的Sepharose 4B、辛基吡喃葡萄糖苷、抑胃肽A、苯甲基磺酰氟、牛血清白蛋白均購自Sigma公司,199細胞培養液為日本進口,低分子標準蛋白購于上海東風生化試劑廠。

  二、方法

  1.白念孢子的培養、收集[2]:取新鮮轉種至葡萄糖蛋白培養基上的白念一鉑環接種于YEPD培養基中,26℃振蕩孵育20小時,離心收集白念孢子(300g,3分鐘),用0.1mol/LTris-HCl緩衝液(含2mmol/L的鈣和鎂)沖洗3次。

  2.白念孢子壁蛋白質提取液的製備[3]:取上述白念孢子約35g(濕重)加入36ml0.1mol/LTris-HCl緩衝液(含2mmol/L鈣和鎂、50mmol/L辛基吡喃葡萄糖苷、6mmol/L苯甲基磺酰氟、2μmol/L抑胃肽A)26℃振蕩孵育40分鐘,高速冷凍離心(4℃)30 000g,90分鐘后,小心抽取上清液,用染料法檢測其蛋白質含量。

  3.Fn粘附素的提取純化:將白念孢子壁蛋白提取液首先上樣到牛血清蛋白(BSA)-Sepharose 4B凝膠柱,用緩衝液A(含有2mmol/L的鈣、鎂和50mmol/L辛基吡喃葡萄糖苷的緩衝液)徹底沖洗至核酸蛋白檢測儀A280時記錄儀回到基線,然後將得到的洗脫液上樣到Fn-Sepharose 4B,使其在層析柱中反覆循環,速度為1ml/分鐘,90分鐘后,Fn-Sepharose 4B柱先用緩衝液A徹底沖洗至A280回到基線,后改用緩衝液B[不含有鈣和鎂,含有10mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、50mmol/L的辛基吡喃葡萄糖苷的緩衝液]洗脫,收集蛋白峰對應的洗脫液,4℃冰箱中透析48小時,濃縮後進行SDS-PAGE。最後用1NNaCl再生Fn-Sepharose 4B柱。

  4.Fn-Sepharose 4B及BSA-Sepharose 4B的製備[4]:取溴化氰活化的Sepharose 4B放入小砂芯漏斗中,用預冷的0.1mol/L碳酸氫鈉緩衝液沖洗后加入Fn或牛血清白蛋白,然後將上述混合物在4℃冰箱中用磁力攪拌器緩慢攪拌16~20小時進行偶聯,最後用緩衝液徹底沖洗,直到流出液中沒有蛋白質(A280低於0.02)為止。加防腐劑0.02%疊氮鈉,貯存于4℃冰箱備用。

  5.SDS-PAGE:採用分離膠為5%~15%連續梯度凝膠,0.25%考馬斯亮藍R250溶液染色

  6.白念孢子懸液的製備:將培養收集的白念,用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩衝液(PBS)離心洗滌3次(300×g,3分鐘),然後加入199細胞培養液,用血細胞計數板調整至所需要的各種濃度

  7.頰粘膜上皮細胞(BEC)懸液的製備[5]:用無菌棉簽輕輕刮取受檢者(正常學員10例,每次實驗來自同一人群)兩側頰粘膜,用上述緩衝液離心洗滌3次,調整至所需要的各種濃度,具體方法同上。

  8.粘附抑制實驗[6]:將上述製備的兩種懸液各0.25ml加入試管中,其中上皮細胞濃度為106/ml,白念孢子為108/ml,在培養箱(37℃)中振蕩孵育2小時后,使混合液通過12μm的過濾薄膜,再用pH7.4的PBS徹底沖洗,以除去未粘附到上皮細胞的白念孢子。然後將過濾薄膜倒置在載物片上2分鐘,風乾,熱固定後進行革蘭染色。在顯微鏡下計數,其中粘附孢子數20個以上的上皮細胞記(+),共數出100個,計算出粘附百分率。先將Fn粘附素(100μg)加入到上皮細胞懸液中,37℃振蕩孵育60分鐘后,再加入白念孢子懸液,計算粘附百分率,具體方法同前。

  9.統計學方法:這種同一觀察單位前後二次測定結果的比較用t檢驗,所有數據的表示用平均值±標準差

  結 果

  1.白念孢子的收集及壁蛋白提取的結果:1000mlYEPD培養基共收集35g白念孢子,大約得到3.2mg的蛋白(用染料法測定蛋白含量)。

  2.Fn粘附素提取純化的結果:見圖1。3.2mg白念孢子壁蛋白溶液經Fn-Sepharose 4B親和層析柱后得到Fn粘附素大約20μg,SDS-PAGE見圖2。

 a:沒有結合到層析柱上而用緩衝液A洗脫下來的蛋白峰,b:結合到層析柱上而用緩衝液B洗脫下來的蛋白峰即纖連蛋白粘附素,c:親和層析柱的再生峰,A:緩衝液A,B:緩衝液B

  圖1 白念孢子壁蛋白質提取液經纖連蛋白Sepharose 4B親和層柱的洗脫曲線

圖2 纖連蛋白經純化后SDS-PAGE

  3.粘附抑制實驗:白念與上皮細胞的粘附百分率為44.7±6.28;上皮細胞經Fn粘附素預處理后,粘附百分率為28.3±6.18,t=9.836,P<0.01(粘附率是4次實驗得到的±s,每次計數均重複一次)。

  討 論

  研究表明白念與宿主細胞間的粘附是其侵入宿主引起感染的前提,在介導白念與宿主細胞的粘附中,Fn起了重要作用。Fn是大多數宿主細胞上廣泛存在的糖蛋白,在細胞粘附、細胞移動炎症浸潤創傷愈合等方面均有重要作用。而這些功能的發揮大部分是從介導細胞粘附開始的,因此Fn介導的細胞粘附尤其引人重視。Skerl[1]發現白念對Fn的粘附在許多方面與白念對上皮細胞的粘附非常相似。他們用間接免疫熒光技術,在許多上皮細胞表面都檢測到Fn的存在。當把白念孢子和Fn及Fn的單抗共同孵育后,電鏡顯示孢子周圍有顆粒狀的沉積,證明Fn結合在白念孢子的表面。用Fn預處理白念后,可以阻止其對人頰粘膜上皮細胞和XX粘膜上皮細胞的粘附。Kloze等[7]證實了Fn對白念的結合具有特異性、高親和性和飽和性。這些結果表明Fn作為宿主細胞表面的受體而發揮作用,白念表面有與Fn結合的粘附素。

  本實驗即在已有研究基礎上用Fn做親和配體,運用親和層析技術從白念孢子壁蛋白提取液分離純化與Fn結合的粘附素,並驗證該蛋白能抑制白念與上皮細胞的粘附。要分離純化白念表面的粘附素,首先要使白念表面的蛋白溶解,然後才能根據其特性進行分離。去垢劑能削弱膜蛋白與膜脂質分子間的疏水結合,使膜蛋白從膜脂質雙分子層中溶脫,同時又能保持膜蛋白原有構象和功能。所以我們應用去垢劑辛基吡喃葡萄糖苷提取白念孢子壁蛋白質,其不僅極易去除,而且得率高,另外我們還增加了蛋白酶抑製劑以阻止內源性蛋白酶對錶面蛋白的消化溶解,進一步提高了蛋白含量。用金屬螯合劑去除鈣能夠抑制白念粘附的80%~90%[HT6〗[3],因此我們運用Fn做親和配體,用含EDTA的緩衝液B解吸親和層析柱,而獲得Fn粘附素,非還原狀態下進行SDS-PAGE,得到表觀分子量為105 000和60 000的兩條蛋白帶,這與Klotz[3]的報道相似。其中105 000的蛋白帶較淡,可能是由於在冰箱中透析貯存而引起蛋白解聚,這提示此蛋白可能是一個以60 000為基礎的二聚體[8]。我們採用的親和層析方法簡單而特異,Fn-Sepharose 4B柱再生后可以反覆使用。並在Klotz的基礎上做了改進,首先我們對白念的量及其與緩衝液的比例做了調整,增加白念孢子到35g,緩衝液增加到36ml,這樣增加了白念孢子壁蛋白的含量,Fn粘附素的量也隨之增加,電泳后我們即可採用常規考馬斯亮藍染色,避免了銀染,從而簡化了實驗步驟。其次我們將超速離心改為高速離心,只相應延長了高速離心的時間,其結果是相同的,這樣即降低了實驗成本,又簡化了實驗方法。在粘附抑制實驗中我們先把白念孢子與上皮細胞共同孵育后測其粘附率,然後加入Fn粘附素再測其粘附率,結果顯示Fn粘附素明顯地抑制了白念對上皮細胞的粘附,可能是由於Fn粘附素佔據了上皮細胞表面的Fn受體而影響了它們之間的粘附。從而提示白念與宿主細胞之間存在著粘附受體機制,而且這種粘附是通過白念表面Fn與宿主細胞表面Fn粘附素的特定結合而介導的。

  本實驗從三個方面證實所得到的蛋白是Fn粘附素,首先親和層析本身就是利用受體與配體結合的特異性;其次,我們得到的蛋白達到電泳純,SDS-PAGE的電泳行為與文獻報道吻合;第三,粘附抑制實驗驗證其介導白念與上皮細胞的粘附。

  本文為國家自然科學基金資助項目

  參考文獻

  1 Skerl KG, Calderone RA, Segal E, et al. In vitro binding of Candida albicans yeast cells to human fibronectin. Can J Mic robiol, 1984,30∶221-227.

  2 Casanova M, Chaffin WL. Cell wall glycoproteins of Candida albi cans as released by different methods. J Gen Microbiol, 1991,137∶1046-1051.

  3 Klotz SA, Rutten MJ, Smith RL, et al. Adherence of Candida albi cans to immobilized extracellular matrix proteins is mediated by calcium-depend ent surface glycoproteins. Microb Pathog, 1993,14∶144-147.

  4張龍翔.生化實驗方法和技術.北京:人民教育出版社,1981.112-113.

  5 Staddon W, Todd T, Irvin RT. Equilibrium analysis of binding of Candida albicans to human buccal epithelial cells. Can J Microbiol, 1990,36∶33 6-340.

  6 Fukayama M, Calderone RA. Adherence of cell surface mutants of Candida albicans to buccal epithelial cells and analyses of the cell surface pro teins of the mutants. Infect Immun, 1991,59∶1341-1345.

  7 Klotz SA, Smith RL. A fibronectin receptor on Candida albicans mediates adherence of the fungus to extracellular matrix. Infect Dis, 1991,163∶ 606-610.

  8 Klotz SA, Chin RC, Smith RL, et al. The fibronectin adhesin of Candida albicans. Infect Immun, 1994,62∶4679-4681.