金黃色葡萄球菌A蛋白

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1簡介編輯 金黃色葡萄球菌A蛋白

金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A簡稱SPA)是細胞抗原的主要成分幾乎90%以上的菌株均含有這種成分但不同的菌株含量差別十分懸殊SPA占整個細胞壁蛋白成分的6.7%通過胞壁肽聚糖共價鍵與之結合其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌不含SPA

觀察分析金黃色葡萄球菌A蛋白膠體金SPA-CG分子的特徵性構象特點探討其作為原子力顯微鏡觀測原位標記物的可行性

觀察方法應用原子力顯微鏡掃描生理狀態下分佈雲母表面的金黃色葡萄球菌A蛋白膠體金分子並進行結構分析及理論計算

結果極少數平卧的SPA-CG呈中部球形隆起兩端長短不一的彎曲棒狀肽鏈環抱球形隆起的獨特結構形成反C字形結構球形隆起直徑為單個膠體金直徑的3~4倍極少數SPA-CG呈逗號樣絕大多數SPA-CG呈一側面稍凹的橢球形結構結構穩定均一長徑為4088±158nm寬徑為2082±068n高度Z軸為1051±028nm

單個膠體金標記的金黃色葡萄球菌A蛋白分子具有獨特穩定均一的特徵性構象可作為原子力顯微術觀測的原位標記物

2SPA的理化性質編輯SPA是一種蛋白質,由亮纈脯丙蘇甘絲谷丙天門冬賴氨酸等十種氨基酸組成由於不含有胱氨酸半胱氨酸所以無二硫鍵紫外光譜和吸收係數為A275nm %=1.65等電點為pH5.1SPA十分穩定用4mol/L尿素硫氰鹽酸6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件以及加熱煮沸均不影響其活性其分子量因測定方法不同而有所差異

3SPA部分理化參數編輯分子量 金黃色葡萄球菌A蛋白

42 000

沉降係數S 20w(ˊS )

2.10

擴散係數D20W(cm2/s)

4.3×10-7

Stocks半徑(nm)

5.00

摩擦比f/f,min

2.10

粘度(n) (ml/g)

2.90

Hμggins常數

0.66

比容V(ml/g)

0.72

4SPA的免疫學性質編輯SPA能與人及多種哺乳動物血清IgG分子中的Fc片段結合結合的親和性次序依次是豬狗兔人 金黃色葡萄球菌A蛋白

猴鼠小鼠及牛對大白鼠綿羊的親和力差對馬犢牛山羊等無親和力對所有的魚類兩棲類爬行類鳥類除少數例外均不能與之結合雞的IgG必須與相應的抗原形成複合物才能與SPA結合原因可能是Ag-Ab複合物改變了IgG的Fc片段的構象

SPA與IgG結合的亞類主要是IgG1IgG2和IgG4

SPA除與IgG結合外還能與血清中少量的IgM和IgA結合SPA菌對各類免疫球蛋白吸附率IgG為90%~98%IgM為2%~30%IgA為1.5%~20%

出現共沉反應的SPA與IgG必須有兩個結合部位它們分別在Fc和Fab段上,缺一雖能與SPA結合但不出現共沉反應這種Fab的參與並非SPA-抗體反應現已研究表明IgG與SPA的結合部位是CH2和CH3的交界處

5SPA的生物學特性編輯1免疫原性與過敏原性 SPA做為免疫原能刺激免疫活性細胞合成Ig又能與其相應抗體的Fab段結合 金黃色葡萄球菌A蛋白

呈現抗原抗體的特異XXSPA-IgG注XX家兔皮下可引起Arthus樣反應還可引起豚鼠的遲發性超敏反應SPA體外試驗能刺激豚鼠離體迴腸收縮

2抗吞噬作用 由於IgG的Fc段結合點既是lgG調理活性結合點又是SPA反應點因此SPA可與吞噬細胞競爭結果抑制了多形核白細胞的吞噬作用也可能是SPA阻斷調理素與吞噬細胞作用的結果

3固定補體 SPA-IgG和免疫複合物一樣可以固定人和某些動物(如豚鼠豬狗等)血清中的補體主要是通過補體傳統激活途徑

4促有絲分裂因子 SPA是一種B細胞激活劑固相SPA作用明顯並不需要T細胞輔助,可容性SPA作用微弱必須有T細胞參與

5去封閉作用 固相SPA能部分去除腫瘤病人和帶瘤動物血清中的封閉活性從而降低了血清對淋巴細胞介導的細胞毒的封閉作用

6SPA的應用編輯SPA應用很廣但所有應用的原理都離不開SPA具有與IgG的Fc段的結合能力主要應用方面如下 金黃色葡萄球菌A蛋白

1SPA菌的協同凝集作用

用已知的標準血清吸附到SPA菌的表面,使之成為吸附抗體的載體,再以此去診斷相應的未知抗原而產生肉眼可見的凝集顆粒,診斷的抗原可以是顆粒性的,也可以是可溶性的此種凝集相當於反向間接血凝,但省去間接血凝中的抗體純化,紅血球鞣化等複雜手續,而只需要 SPA菌體及粗製免疫血清即可所以此法簡單快速,特異性感性均較滿意目前已用於許多細胞病毒的檢測及分型

協同凝集只適用於檢測抗原未見應用於檢測抗體的報道

2作為廣譜第二抗體 用SPA代替抗體IgG的第二抗體有如下優點①SPA製備容易性質穩定易純化    對人和多種哺乳動物的IgG都能應用,不受種屬限制而第二抗體的製備比較麻煩且需多次免疫動物在應用上要受同種屬的限制②SPA的結合力強相當於遊離抗體與抗原的結合力對人和兔的親和常數均為103 L/克分子結合后對IgG的活性無影響無論在0℃37℃44℃及56℃幾乎均能立即結合而無需長時間的孵育因此可以縮短試驗時間第二抗體在較長的孵育中出現抗原分解的問題也可以得到解決③SPA容易標上125 I熒光素辣根氧化物酶鐵蛋白等因此可與多種技術相結合④在檢查細胞上的病毒抗原時第二抗體往往特異性不強會非特異性地與細胞膜上的Fc受體結合SPA分子高度均一它不是免疫球蛋白不受Fc受體影響所以有較高的抗IgG特異性⑤用第二抗體做免疫沉澱試驗時必須將抗免疫球蛋白的濃度調整至等價才能產生最佳的沉澱作用而用SPA菌沉澱不受此限制能保證徹底的沉澱⑥SPA與lgG結合是可逆的用4mol/L尿素4mol/L硫氰酸鹽酸(pH2.5)或鳥嘌呤鹽酸鹽等都可以使之重新解離

3用於提取純化IgG 利用SPA與IgG的結合特性提取IgG比常規採用硫酸銨Sephadex柱DEAE柱或免疫梯度離心等法要簡便得多而且純度好

4檢測和提純IgM IgM在病毒的早期診斷中具有重要意義為了檢測特異性IgM抗體必須首先在血清中除去IgG採用SPA菌吸附IgG是目前快速而又理想的辦法利用此法也為IgM的提純開闢了道路

5其它方面 用於免疫複合物的檢測體外激活補體功能試驗細胞表面標記以及腫瘤表面抗原的檢測等

6SPA在免疫細胞化學染色中的應用

SPA可為多種示蹤物如熒光素酶膠體金鐵蛋白等所標記應用較廣的為酶標記SPA和金標記SPA技術後者將在第七章 中敘述標記SPA常用的酶為HRP可應用於間接法SPA在PAP法中可代替橋抗體 1.SPAHRP用於間接法的操作步驟

金黃色葡萄球菌A蛋白

(1)切片經脫蠟後用0.5%H2O2純甲醇處理5min以抑制內源性過氧化物酶活性

(2)用Tris鹽酸緩衝液洗2次每次3min

(3)以第一抗體血清覆蓋處理切片37℃孵育30min或4℃24~48h

(4)用Tris-HCl緩衝液洗3次每次5min

(5)加SPA-HRP處理30min

(6)Tris-HCl緩衝液洗3次每次5min

(7)DAB-H2O2顯色

(8)復染脫水透明封固反應物為棕色

2.SPA用於PAP法的操作步驟

(1)切片脫蠟至水洗

(2)80%甲醇(含0.6%H2O2)封閉內源酶活性5min

(3)10%卵白蛋白Tris緩衝液20min

(4)第一抗體作用37℃30min或4℃ 16~48h

(5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl緩衝鹽液洗片5min

(6)SPA(1μg/ml)5min

(7)Tris-HCl鹽液洗5min

(8)PAP複合物(無種屬限制)5min

(9)Tris-HCl鹽液洗切片5min

(10)DAB(0.6mg/ml)加0.01%H2O2反應5min然後水洗

(11)復染常用Mayers蘇木XX數秒至1min水洗

(12)脫水透明封固鏡檢 3.SPA-HRP的製備 應用Nakane和Kawaoi1974年建立的過碘酸法酶SPA=21即HRP10mgSPA5mg

(1)10mg 溶於新鮮配製的pH8.10.3mol/L碳酸氫鈉溶液1ml加入0.1ml 1%二硝基氟苯無水乙醇溶液以封閉酶分子中的氨基使不發生酶的自身聚合室溫輕輕攪拌1h

(2)加入1ml0.04~0.08mol/L的NaIO4室溫攪拌30min

(3)加入1ml0.16mol/L乙二醇室溫輕攪1h

(4)對1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸鹽緩衝液充分透析換緩衝液3次

(5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸鈉緩衝液1ml室溫輕攪2~3h

(6)加5mg硼氫化鈉終止氧化置4℃冰箱3h或過夜

(7)對PBS透析24h4℃離心去沉澱半飽和硫酸銨洗沉澱結合物3次溶於1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中

(8)對PBS充分透析經測定後分裝貯于-20℃冰箱中保存備用

用過碘酸鈉法可以得到很高標記率的HRP-SPA標記物而且保存了抗體的全部活性敏感度高穩定性強大大優於戊二醛標記抗體法現在也有HRP-SPA的標記物供應但要注意由於各家所用的SPA可能來源於不同菌株在性質上可能存在一些差異

7標準菌種編輯目前國內使用的大致如下

1含A蛋白的葡萄球菌菌株

⑴ No 1800株系中國科學微生物研究所保存的由上海分離出的菌株其SPA含量活性及濕菌體收穫量與Cowan 1株相似且不易出現自凝現象

⑵ Cowan 1株為SPA豐富的日本引進標準株中國科學院微生物研究所編號為ASI 1476

⑶ 799型菌株從化膿骨科病人的骨標本中分離出含SPA豐富的菌株

⑷ 丹麥1972株由丹麥引進

2不含SPA的葡萄球菌株

⑴ Wood 46株由日本引進編號為ASI 1477

⑵ 乙5株遵義醫學院保存的SPA菌株

8培養基編輯常用的培養基配方如下

1 配方一

蛋白腖 10.00g

葡萄糖 1.00g

氯化鈉 3.00g

Na2HPO4·12H2O 2.00g

牛肉浸液(或5%牛肉膏) 1 000.0ml

混合調pH 7.8

欲配固體培養基則另加瓊脂25.00g

2 配方二

胰酶消化酪蛋白 17.00g

大豆腖 3.00g

氯化鈉 5.00g

葡萄糖 25.00g

Na2HPO4 25.00g

混和調pH 7.3

3 配方三

水解蛋白腖 10.00g

氯化納 5.00g

牛肉膏 10.00g

酵母膏 25.00g

色氨酸 5.00mg

半胱氨酸 100.00mg

瓊脂 40.0g

H2O pH 7.6 1 000.00ml

9性質特點編輯(1)SPA存在於大多數金黃色葡萄球菌中而不存在於表皮葡萄球菌中並且主要存在於血漿凝固酶陽性菌株而不存在於陰性菌株中前者是致病的後者是非致病的但在體內研究中尚未發現SPA和菌株致病性之間有任何肯定的關係不同菌株間的SPA含量有明顯差異以I株金黃色葡萄球菌含SPA量最高SPA和細胞壁的肽聚糖呈共價結合抗二甲氧基青黴素突變株能產生分泌性SPA它較之細胞壁所含的SPA在免疫學性質上相似但易分離損失少 (2)SPA為蛋白質成分僅含少量或不含碳水化合物其分子量因提取方法不同而異用脫氧核糖核酸酶消化細胞壁后超速離心或用加熱油提法所測分子量為12000~15000用沉澱平衡分析和在6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽中凝膠過濾測出分子量為42000SPA為多肽單鏈內含3個高度相似的Fc段結合區每區由50個以上的氨基酸組成不含色氨酸和半胱氨酸其羧基末端是賴氨酸氨基末端結構尚未肯定SPA粘度高於球蛋白等電點為pH5.1其天然結構十分穩定在應用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑的條件下尚能保存某些三級結構如將此變性劑除去則能自然矯正而恢複原有結構

(3)SPA之所以引起免疫學家的重視是因為它具有的免疫學特性SPA具有和人與許多動物如豚鼠豬小鼠猴等IgG結合的能力SPA結合部位是Fc段而不是Fab段這種結合不會影響抗體的活性SPA具有的結合力是雙價的每個SPA分子可以同時結合兩個IgG分子也可一方面同IgG相結合一方面與標記物如熒光素過氧化物酶膠體金和鐵蛋白等相結合還有一個饒有興趣的事實是和SPA結合后的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽等使之解離SPA對IgG免疫球蛋白亞型的結合有選擇性如SPA與人IgG亞型IgG1IgG2和IgG4有結合力唯獨不結合IgG3只結合IgA2而不結合IgA1SPA和禽類血清IgG不結合

(4)SPA具有多種生物學作用如引起豚鼠解離體迴腸和收縮在吞噬反應中抑制IgG調理素吞噬和殺菌作用SPAIgg 複合物能固定人的補體和人狗豬的新鮮補體對人類B細胞具有促有絲分裂因子的作用等