凋亡

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1釋義原義diāo wánɡ

凋亡

謂大量減少陳書·世祖紀自喪亂以來十有餘載編戶凋亡萬不遺一中原氓庶蓋雲無幾

細胞凋亡Apoptosis意指花瓣樹葉脫落凋零強調是自然的生理學過程

現義也稱為固縮壞死程序性細胞死亡或細胞自殺是由基因介導的一系列變化細胞依靠它來主動地引起它自身的破壞正常起消除老化細胞或未參與免疫反應淋巴細胞的凋亡過程如發生病理性干擾可對腫瘤生成起作用凋亡最初由特徵性的形態變化來確定包括DNA的程序性降解染色濃縮細胞縮小和碎裂它可以是生理性的或由化療藥物及放XX誘發來自希臘文apoptosis描寫深秋枯葉從塗寫上掉落的現象

存在於細胞中的自毀機制這個過程機體能清除衰老及異常細胞並在維持很多細胞功能方面有重要作用細胞發生變異癌細胞就是因為關閉了細胞內線粒體的這一調控功能所以才躲過這一調控機制不會自我毀滅

2機理細胞凋亡的過程大致可分為以下幾個階段

接受凋亡信號→凋亡調控分子間的相互作用→蛋白水解酶的活化Caspase→XX連續反應過程

細胞凋亡的啟動是細胞在感受到相應的信號刺激后胞內一系列控制開關的開啟或關閉不同的外界因素啟動凋亡的方式不同所引起的信號轉導也不相同客觀上說對細胞凋亡過程中信號傳遞系統的認識是不全面的比較清楚的通路主要有

1細胞凋亡的膜受體通路

各種外界因素是細胞凋亡的啟動劑它們可以通過不同的信號傳遞系統傳遞凋亡信號引起細胞凋亡我們以Fas -FasL為例

Fas是一種跨膜蛋白屬於腫瘤壞死因子受體超家族成員它與FasL結合可以啟動凋亡信號的轉導引起細胞凋亡它的活化包括一系列步驟首先配體誘導受體三聚體化然後在細胞膜上形成凋亡誘導複合物這個複合物中包括帶有死亡結構域的Fas相關蛋白FADDFas又稱CD95是由325個氨基酸組成的受體分子Fas一旦和配體FasL結合可通過Fas分子啟動致死性信號轉導最終引起細胞一系列特徵性變化使細胞死亡Fas作為一種普遍表達的受體分子可出現于多種細胞表面但FasL的表達卻有其特點通常只出現于活化的T細胞NK細胞因而已被活化的殺傷性免疫細胞往往能夠最有效地以凋亡途徑置靶細胞于死地Fas分子胞內段帶有特殊的死亡結構域DD,death domain三聚化的Fas和FasL結合后使三個Fas分子的死亡結構域相聚成簇吸引胞漿中另一種帶有相同死亡結構域的蛋白FADDFADD是死亡信號轉錄中的一個連接蛋白它由兩部分組成C端DD結構域和N端DED部分DD結構域負責和Fas分子胞內段上的DD結構域結合該蛋白再以DED連接另一個帶有DED的後續成分由此引起N段DED隨即與無活性的半胱氨酸蛋白酶8caspase8酶原發生同嗜XX聯聚合多個caspase8的分子caspase8分子逐由單鏈酶原轉成有活性的雙鏈蛋白進而引起隨後的級聯反應即Caspases後者作為酶原而被激活引起下面的級聯反應細胞發生凋亡因而TNF誘導的細胞凋亡途徑與此類似

2細胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學途經

線粒體是細胞生命活動控制中心它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心而且是細胞凋亡調控中心實驗表明了細胞色素C從線粒體釋放是細胞凋亡的關鍵步驟釋放到細胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與凋亡相關因子1Apaf-1結合使其形成多聚體並促使caspase-9與其結合形成凋亡小體caspase-9被激活被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等從而誘導細胞凋亡此外線粒體還釋放凋亡誘導因子如AIF參與激活caspase可見細胞凋亡小體的相關組份存在於正常細胞的不同部位促凋亡因子能誘導細胞色素C釋放和凋亡小體的形成很顯然細胞色素C從線粒體釋放的調節是細胞凋亡分子機理研究的關鍵問題多數凋亡刺激因子通過線粒體激活細胞凋亡途經有人認為受體介導的凋亡途經也有細胞色素C從線粒體的釋放如對Fas應答的細胞中一類細胞type1中含有足夠的胱解酶8 caspase8可被死亡受體活化從而導致細胞凋亡在這類細胞中高表達Bcl-2並不能抑制Fas誘導的細胞凋亡在另一類細胞type2如肝細胞中Fas受體介導的胱解酶8活化不能達到很高的水平因此這類細胞中的凋亡信號需要借助凋亡的線粒體途經來放大而Bid -- 一種僅含有BH3結構域的Bcl-2家族蛋白是將凋亡信號從胱解酶8向線粒體傳遞的信使

Caspase儘管凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚但是已經確定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡過程中是起著必不可少的作用細胞凋亡的過程實際上是Caspase不可逆有限水解底物的級聯放大反應過程到目前為止至少已有14種Caspase被發現Caspase分子間的同源性很高結構相似都是半胱氨酸家族蛋白酶根據功能可把Caspase基本分為二類一類參與細胞的加工如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ形成有活性的IL-1β和IL-1δ第二類參與細胞凋亡包括caspase2,3,6,7,8,9.10Caspase家族一般具有以下特徵

1)C端同源區存在半胱氨酸激活位點此激活位點結構域為QACR/QG

2通常以酶原的形式存在相對分子質量29000-49000(29-49KD在受到激活后其內部保守的天冬氨酸殘基經水解形成大P20小P10兩個亞單位並進而形成兩兩組成的有活性的四聚體其中每個P20/P10異二聚體可來源於同一前體分子也可來源於兩個不同的前體分子

3未端具有一個小的或大的原結構域

參與誘導凋亡的Caspase分成兩大類啟動酶inititaor和效應酶effector它們分別在死亡信號轉導的上游和下游發揮作用

Caspase的活化Caspase的活化是有順序的多步水解的過程Caspase分子各異但是它們活化的過程相似首先在caspase前體的N-端前肽和大亞基之間的特定位點被水解去除N-端前肽然後再在大小亞基之間切割釋放大小亞基由大亞基和小亞基組成異源二聚體再由兩個二聚體形成有活性的四聚體去除N-端前肽是Caspase的活化的第一步也是必須的但是Caspase-9的活化不需要去除N-端前肽Caspase活化基本有兩種機制即同源活化和異源活化這兩種活化方式密切相關一般來說後者是前者的結果發生同源活化的Caspase又被稱為啟動caspaseinitiator caspase包括caspase-8,-10,-9誘導凋亡後起始Caspase通過adaptor被募集到特定的起始活化複合體形成同源二聚體構像改變導致同源分子之間的酶切而自身活化通常caspase-8,10,2介導死亡受體通路的細胞凋亡分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體複合物而Caspase-9參與線粒體通路的細胞凋亡則被募集到Cyt c/d ATP/Apaf-1組成的凋亡體apoptosome同源活化是細胞凋亡過程中最早發生的capases水解活化事件啟動Caspase活化后即開啟細胞內的死亡程序通過異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號放大同時將死亡信號向下傳遞異源活化hetero-activation即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經典途徑被異源活化的Caspase又稱為執行caspase(executioner caspase包括Caspase-3,-6,-7執行Caspase不象啟動Caspase 不能被募集到或結合起始活化複合體它們必須依賴啟動Caspase才能活化

效應機制凋亡細胞的特徵性表現包括DNA裂解為200bp左右的片段染色質濃縮細胞膜活化細胞皺縮最後形成由細胞膜包裹的凋亡小體然後這些凋亡小體被其他細胞所吞噬這一過程大約經歷30-60分鐘Caspase引起上述細胞凋亡相關變化的全過程尚不完全清楚但至少包括以下三種機制

1) 凋亡抑制物

正常活細胞因為核酸酶處於無活性狀態而不出現DNA斷裂這是由於核酸酶和抑制物結合在一起如果抑制物被破壞核酸酶即可激活引起DNA片段化fragmentation現知caspase可以裂解這種抑制物而激活核酸酶因而把這種酶稱為Caspase激活的脫氧核糖核酸酶caspase-activated deoxyribonulease CAD而把它的抑制物稱為ICAD因而在正常情況下CAD不顯示活性是因為CAD-ICAD以一種無活性的複合物形式存在ICAD一旦被Caspase水解即賦予CAD以核酸酶活性DNA片段化即產生有意義的是CAD只在ICAD存在時才能合成並顯示活性提示CAD-ICAD以一種其轉錄方式存在因而ICAD對CAD的活化與抑制卻是必需要的

2) 破壞細胞結構

Caspase可直接破壞細胞結構如裂解核纖層核纖層Lamina是由核纖層蛋白通過聚合作用而連成頭尾相接的多聚體由此形成核膜骨架結構使染色質chromatin得以形成並進行正常的排列在細胞發生凋亡時核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個近中部的固定部位所裂解從而使核纖層蛋白崩解導致細胞染色質的固縮

3) 調節蛋白喪失功能

Caspase可作用於幾種與細胞骨架調節有關的酶或蛋白改變細胞結構其中包括凝膠原蛋白gelsin聚合粘附激酶focal adhesion kinase,FAKP21活化激酶αPAKα等這些蛋白的裂解導致其活性下降如Caspase可裂解凝膠原蛋白而產生片段使之不能通過肌動蛋白actin纖維來調節細胞骨架

除此之外Caspase還能滅活或下調與DNA修復有關的酶mRNA剪切蛋白和DNA交聯蛋白由於DNA的作用這些蛋白功能被抑制使細胞的增殖與複製受阻併發生凋亡

所有這些都表明Caspase以一種有條不紊的方式進行"破壞"它們切斷細胞與周圍的聯繫拆散細胞骨架阻斷細胞DNA複製和修復干擾mRNA剪切損傷DNA與核結構誘導細胞表達可被其他的細胞吞噬的信號並進一步使之降解為凋亡小體

形態變化細胞皺縮胞漿緻密核染色質邊集而後胞核裂解胞漿芽突並脫落形成含核碎片和或細胞器成份的膜包被凋亡小體apoptosis body可被巨噬細胞和相鄰其他實質細胞吞噬降解

生化特徵Ca2+/mg2+依賴的內切核酸酶endogenous nuclease及需鈣蛋白酶calpain活化早期出現180~200bp的DNA降解片段瓊脂凝膠電泳呈現特徵性梯帶狀半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶和凋亡蛋白酶caspases活性增高

參與凋亡過程的相關基因有幾十種其中FasBaxP53等基因有促進凋亡作用Bcl-2Bcl-XL等基因有抑制凋亡作用而c-myc等基因則具有雙向調節作用

3檢測早期1) PS(磷脂酰絲氨酸在細胞外膜上的檢測

2細胞內氧化還原狀態改變的檢測

3細胞色素C的定位檢測

4) 線粒體膜電位變化的檢測

晚期細胞凋亡晚期中核酸內切酶核小體之間剪切核DNA產生大量長度在180-200 bp 的DNA片段

對於晚期檢測通常有以下方法

1) TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記

2) LM-PCR Ladder 連接介導的PCR檢測

3) Telemerase Detection (端粒酶檢測

生化方法1典型的生化特徵DNA 片段化

2檢測方法主要有瓊脂糖凝膠電泳原位末端標記TUNEL等

3)TUNEL末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記

4通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP 多為dUTP間接或直接接到DNA片段的3-OH端再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果可做細胞懸液福爾馬林固定或石蠟處理組織細胞培養物等多種樣本的檢測

LM-PCR連接介導的PCR檢測

當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少如活體組織切片時直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化通過LM-PCR連上特異性接頭專一性地擴增梯度片段從而靈敏地檢測凋亡時產生梯度片段此外LM-PCR 檢測是半定量的因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較如果細胞量很少還可在分離提純DNA後用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶TdT使DNA標記然後進行電泳和放XX自顯影觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成

上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特徵但細胞受到其它損傷如機械損傷紫外線等也會產生這一現象因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾需結合其它的方法來檢測細胞凋亡花開花謝似水流年……

其它方法1)Telemerase Detection 端粒酶檢測

端粒酶是由RNA和蛋白組成它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重複序列使細胞獲得永生化正常體細胞是沒有端粒酶活性的每分裂一次染色體的端粒會縮短這可能作為有絲分裂的一種時鐘表明細胞年齡複製衰老或細胞凋亡的信號研究發現90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性

2)mRNA水平的檢測

研究者們發現了很多在細胞凋亡時表達異常的基因檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法據報道Fas 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞cytotoxic T cells等靶細胞Bcl-2 和bcl-X 長的 作為抗凋亡bcl-2 和bcl-X的調節物它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活用熒光定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確通過檢測fas,bax-alpha 和 bcl-X 長的 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測

內氧化還原正常狀態下谷光苷肽GSH作為細胞的一種重要的氧化還原緩衝劑細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原這一反應在線粒體中尤為重要許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除當細胞內GSH的排除非常活躍時細胞液就由還原環境轉為氧化環境這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低從而使細胞色素C三羧酸循環中的重要組分從線粒體內轉移到細胞液中啟動凋亡效應器caspase的級聯反應花開花謝似水流年……

C的定位細胞色素C作為一種信號物質在細胞凋亡中發揮著重要的作用正常情況下它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞漿結合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后啟動caspase級聯反應細胞色素C/Apaf-1複合物激活caspase-9後者再激活caspase-3和其它下游caspase

電位變化1線粒體跨膜電位的耗散與細胞凋亡有密切關係

2陸續有報道說明線粒體跨膜電位的耗散早於核酸酶的激活也早於磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面而一旦線粒體跨膜電位耗散細胞就會XX不可逆的凋亡過程

3在細胞凋亡過程中線粒體跨膜電位的耗散主要是由於線粒體內膜的通透性轉變這是由於生成了動態的由多個蛋白質組成的位於線粒體內膜與外膜接觸位點的通透性轉變孔道PT孔道能穩定線粒體跨膜電位就能防止細胞凋亡

線粒體在細胞凋亡作用中的進一步證據

1若將純化的正常的線粒體與純化的細胞核在一起保溫並不導致細胞核的變化但若將誘導生成PT孔道的線粒體與純化的細胞核一同保溫細胞核即開始凋亡變化

2形態學觀察看到細胞數目有限統計學上的準確性受影響

3凝膠電泳檢測DNA破壞了細胞的完整性也不能測出凋亡細胞占總細胞的比例

4)流式細胞術可檢測細胞亞細胞及分子水平的特徵性變化

用於流式細胞儀檢測的染料

PIHoechst EB DAPI丫啶橙等其中PIHoechst最常用

PI和Hoechst33342雙標

PIHoechst33342均可與細胞核DNA或RNA結合但是PI不能通過正常的細胞膜Hoechst則為膜通透性的熒光染料故細胞在處於壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞這時可為PI著紅色正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hoechst著色但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形淡藍色內有較深的藍色顆粒而凋亡細胞的核由於濃集而呈亮藍色或核呈分葉碎片狀邊集

故PI著色為壞死細胞亮藍色或核呈分葉狀邊集的Hoechst著色的為凋亡細胞

PI和Annexin-V雙標

磷脂酰絲氨酸PS正常位於細胞膜的內側但在細胞凋亡的早期或細胞損傷時PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面暴露在細胞外環境中

Annexin-Vgreen可以和磷脂酰絲氨酸PS特異性結合因此細胞處於凋亡或壞死時Annexin-V可為陽性早期的壞死細胞可能為陰性但是只有壞死的細胞PI是陽性

4形態觀測1普通光學顯微鏡觀察

2透XX電子顯微鏡觀察

3熒光顯微鏡觀察

普通光鏡1用蘇木素-伊紅HE染色細胞核固縮碎裂呈藍黑色胞漿呈淡紅色凋亡細胞正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失

2)Giemsa染色法瑞氏染色法等正常細胞核的色澤均一凋亡細胞染色變深壞死細胞染色淺或沒染上顏色

倒置顯微鏡1細胞體積變小全面皺縮

2凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍

透XX電子顯微鏡凋亡細胞體積變小細胞質濃縮

細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期Ⅰ期的細胞核呈波紋狀或呈折縫樣部分染色質出現濃縮狀態Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚邊緣化Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊產生凋亡小體

熒光顯微鏡常用的熒光染料丫啶橙 PI DAPIHoechst33258 和Hoechst33342EB等

Hoechst 33342Hoechst 33258 DAPI三種染料與DNA的結合是非嵌入式的主要結合在DNA的A-T鹼基紫外光激發時發XX明亮的藍色熒光

1)PI雙染色法基本原理

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料能XX正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高

DAPI為半通透性用於常規固定細胞的染色

碘化丙啶PI是一種核酸染料它不能透過完整的細胞膜但在凋亡中晚期的細胞和死細胞PI能夠透過細胞膜而將細胞核染紅因此將Annexin-V與PI匹配使用就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來

注意事項細胞凋亡時其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標誌之一但這種DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低或者是因為DNA結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致在分析結果時應該注意

5實驗分析細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段然後大約30 ﹪的染色體DNA在Ca ²+和Mg²+依賴的核酸內切酶作用下在核小體單位之間被隨機切斷形成180~200bp核小體DNA多聚體DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶TdT的作用下將脫氧核糖核苷酸和熒光素過氧化物酶鹼性磷酸化酶生物素形成的衍生物標記到DNA的3-末端從而可進行凋亡細胞的檢測這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法TUNEL由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂因而沒有3-OH形成很少能夠被染色低分子量的DNA分離后也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯nick translation使低分子量的DNA標記或染色然後分析凋亡細胞TUNEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特徵可用於石蠟包埋組織切片冰凍組織切片培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定並可檢測出極少量的凋亡細胞靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛採用

酶的標記原理脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[digoxigenin-11-dUTP]在TdT酶的作用下可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端與dATP形成異多聚體並可與連接了報告酶過氧化物酶或鹼性磷酸酶的抗地高辛抗體結合在適合底物存在下過氧化物酶可產生很強的顏色反應特異準確的定位出正在凋亡的細胞因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察

毛地黃植物是地高辛的唯一來源在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體因而非特異XX很低抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1%若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用

該方法可以用於福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定

試劑配製1磷酸緩衝液PBSpH7.4磷酸鈉鹽 50mMNaCl 200mM

2蛋白酶K(200μg/mlpH7.4蛋白酶K 0.02gPBS 100ml

3含2%H2O2的PBS緩衝液pH7.4H2O2 2.0mlPBS緩衝液 98.0ml

4TdT酶緩衝液新鮮配Trlzma鹼 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2加ddH2O定容到1000ml再加入二甲砷酸鈉 2996g和氯化鈷0.238g

5TdT酶反應液TdT酶32μlTdT酶緩衝液 76μl混勻置於冰上備用

6洗滌與終止反應緩衝液氯化鈉 17. 4g檸檬酸鈉 8.82gddH2O 1000ml

70.05%二氨基聯苯DAB溶液DAB 5mgPBS 10mlpH7.4臨用前過濾后加過氧化氫至0.02%

80.5%甲基綠pH4.0甲基綠0.5g0.1M乙酸鈉100ml

9100%丁醇100%95%90%80%和70%乙醇二甲苯10%中性甲醛溶液乙酸松香水等

10過氧化物酶標記的抗地高辛抗體ONCOR

實驗步驟1標本預處理

⑴石蠟包埋的組織切片預處理將組織切片置於染色缸中用二甲苯洗兩次每次5min用無水乙醇洗兩次每次3min用95%和75%乙醇各洗一次每次3min用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug/ml于室溫水解15min去除組織蛋白用蒸餾水洗4次每次2min然後按下述步驟2進行操作

⑵冰凍組織切片預處理將冰凍組織切片置10%中性甲醛中於室溫固定10min後去除多餘液體用PBS洗兩次每次5min置乙醇乙酸21的溶液中於-20℃處理5min去除多餘液體用PBS洗兩次每次5min然後按下述步驟2進行操作

⑶培養的或從組織分離的細胞的預處理將約 5 × 107個/ml細胞于 4%中性甲醛室溫中固定 10min在載玻片上滴加 50~100μl細胞懸液並使之乾燥用PBS洗兩次每次5min然後按下述步驟2進行操作

2色缸中加入含2%過氧化氫的PBS于室溫反應5min用PBS洗兩次每次5min

3用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多餘液體立即在切片上加2滴 TdT酶緩衝液置室溫1~5min

4用濾紙小心吸去切片周圍的多餘液體立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液置濕盒中於37C反應 1hr注意陰性染色對照加不含TdT酶的反應液

5將切片置於染色缸中加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩衝液于37℃保溫30min每10min將載玻片輕輕提起和放下一次使液體輕微攪動

6組織切片用PBS洗 3次每次 5min后直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體于濕盒中室溫反應30min

7用PBS洗4次每次5min

8在組織切片上直接滴加新鮮配製的0.05%DAB溶液室溫顯色3~6min

9用蒸餾水洗4次前3次每次1min最後1次5min

10于室溫用甲基綠進行復染10min用蒸餾水洗3次前兩次將載玻片提起放下10次最後1次靜置30s依同樣方法再用100%正丁醇洗三次

11用二甲苯脫水3次每次2min封片乾燥后在光學顯微鏡下觀察並記錄實驗結果

注意事項一定要設立陽性和陰性細胞對照陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本陽性細胞對照可使用地塞米松1μM處理3-4hr的大小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞陰性對照不加TdT酶其餘步驟與實驗組相同

細胞產生不可修復的DNA損傷后通常會程序性死亡或稱凋亡然而在腫瘤細胞中這一機制失去作用所以它能夠肆意增殖拒絕接受自殺的命令德國科學家發現了其中的可能原因腫瘤細胞會降解一種能觸發凋亡的蛋白抑制這種蛋白的降解能夠使凋亡機制恢復作用並將提升放療和化療的效力相關論文發表在自然細胞生物學Nature Cell Biology上

嚴重DNA損傷后觸發凋亡的其中一類蛋白是HIPK2分子德國癌症研究中心的Thomas Hofmann和同事研究發現HIPK2不斷在健康細胞中產生但一種名為Siah-1的酶將它標記為垃圾所以它又立刻被降解

輕微損傷的細胞會XX一種低級警戒狀態短時間內抑制HIPK2的降解一旦損傷得到修復細胞會立即恢復對HIPK2的降解只有在嚴重損傷比如DNA雙鏈均遭破壞的細胞中HIPK2的降解才被永久性地抑制結果HIPK2不斷積累觸發凋亡細胞自殺

研究人員推測這可能就是放療和化療有時失效的原因這兩種治療方法都會嚴重損傷腫瘤細胞最終導致它們的程序性死亡Thomas Hofmann說如果有抵抗發生經常是由於腫瘤細胞拒絕執行自殺的命令

研究人員在實驗中抑制了Siah-1酶結果發現即使在輕微損傷的細胞中HIPK2也能夠積聚凋亡也被觸發Hofmann推測癌醫學將可能利用這一發現比如我們可以將Siah-1抑製劑與放療或化療結合使用從而將細胞拉回到凋亡機制中來


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