聚合酶

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1聚合酶-簡介編輯 聚合酶結構圖

1957年美國科學家阿瑟·科恩伯格Arthur Kornberg首次在大腸桿菌中發現DNA聚合酶這種酶被稱為DNA聚合酶IDNA polymerase I簡稱Pol I1970年德國科學家羅爾夫·克尼佩爾斯Rolf Knippers發現DNA聚合酶IIPol II隨後DNA聚合酶IIIPol III被發現原核生物中主要的DNA聚合酶及負責染色體複製的是Pol III

2聚合酶-分類編輯 聚合酶醫學用途

可分為以下幾個類群:(1)依賴DNA的DNA聚合酶(2)依賴RNA的DNA聚合酶(3)依賴DNA的RNA聚合酶(4)依賴RNA的RNA聚合酶前兩者是DNA聚合酶它使DNA複製鏈按模板順序延長如在原核生物中僅就大腸桿菌中已被發現的就有三種(分別簡稱為PolⅠPolⅡ和PolⅢ等)DNA聚合酶只能在有引物的基礎上即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸這DNA的合成方向記為5′→3′換言之DNA聚合酶催化反應除底物(αNTP)外還需要Mg2+ 模板DNA和引物迄今細胞內尚無發現可從單體起始DNA的合成同樣上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反應中最主要的RNA合成酶它們以四種三磷酸核糖核苷(NTP)為底物並需有DNA模板以及Mn2 及Mg2 的存在下在前一個核苷酸3′-OH與下一個核苷酸的5′-P聚合形成3′5′-磷酸二酯鍵其新生鏈的方向也是5′→3′RNA聚合酶也大量存在於原核和真核生物的細胞中如大腸桿菌RNA聚合酶分子量4.8×105由5條多肽鏈組成分別命名為ααββ′和γ全酶可用α2ββ′λ表示真核生物RNA聚合酶分子大於5×105由10~12個大小不等亞基組成聚合酶除作為自然界生命活動中不可缺少的組分外在實驗室中大多用作生命科學研究的工具酶類之一

3聚合酶-特性編輯聚合作用在引物 聚合酶結構圖

RNA'-OH末端以dNTP為底物按模板DNA上的指令由DNApolⅠ逐個將核苷酸加上去就是DNApolⅠ的聚合作用酶的專一性主要表現為新XX的脫氧核苷酸必須與模板DNA配對時才有催化作用dNTPXX結合位點后可能使酶的構象發生變化促進3'-OH與5'-PO4結合生成磷酸二酯鍵若是錯誤的核苷酸XX結合位點則不能與模板配對無法改變酶的構象而被3'-5'外切酶活性位點所識別切除

3'5'外切酶活性校對作用這種酶活性的主要功能是從3'→5'方向識別和切除不配對的DNA生長鏈末端的核苷酸當反應體系中沒有反應底物dNTP時由於沒有聚合作用而出現暫時的遊離現象從而被3'→5'外切酶活性所降解如果提高反應體系的溫度可以促進這種作用這表明溫度升高使DNA生長鏈3'末端與模板發生分離的機會更多因而降解作用加強當向反應體系加入dNTP而且只加放與模板互補的上述核苷酸才會使這種外切酶活性受到抑制並繼續進行DNA的合成由此推論3'→5'外切酶活性的主要功能是校對作用當加入的核苷酸與模板不互補而遊離時則被3'→5'外切酶切除以便重新在這個位置上聚合對應的核苷酸在某些T4噬菌體突變株中DNA複製的真實性降低而易發生突變從此突變株分離得到的聚合酶的3'→5'外切酶活性很低相反另外一些具有抗突變能力的T4突變株中的聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高得多因此其DNA複製真實性好變異率低可見3'→5'外切酶活性對DNA複製真實性的維持是十分重要的

聚合酶分子反應示意圖

5'3'外切酶活性切除修復作用5'→3'外切酶活性就是從5'→3'方向水解DNA生長鏈前方的DNA鏈主要產生5'-脫氧核苷酸這種酶活性只對DNA上配對部份(雙鏈)磷酸二酯鍵有切割活力作用方向是5'→3'每次能切除10個核苷酸而且DNA的聚合作用能刺激5'→3'外切酶活力達10倍以上因此這種酶活性在DNA損傷的修復中可能起著重要作用對岡崎片段5'末端DNA引物的去除依賴此種外切酶活性

焦磷酸解作用DNApolⅠ的這種活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子這種作用就是無機焦磷酸分解DNA生長鏈可以認為是DNA聚合作用的逆反應而且這種水解DNA鏈作用需要有模板DNA的存在(dNMP)n XPPi←(dNMP)n-x X(dNPPP)→DNA

焦磷酸交換作用催化dNTP末端的PPi同無機焦磷酸的交換反應反應式為32P32Pi dNPPP←dNP32P32P PPi→DNA

最後兩種作用都要求有較高濃度的PPi因此在體內由於沒有足夠高的PPi而無重要意義DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性協同作用可以使DNA鏈上的切口向前推進即沒有新的DNA合成只有核苷酸的交換這種反應叫缺口平移(Nicktranslation)當雙鏈DNA上某個磷酸二酯鍵斷裂產生切口時DNApoIⅠ能從切口開始合成新的NDA鏈同時切除原來的舊鏈這樣從切口開始合成了一條與被取代的舊鏈完全相同的新鏈如果新摻入的脫氧核苷酸三磷酸為α-32P-dNTP則重新合成的新鏈即為帶有同位素標記的DNA分子可以用作探針進行分子雜交實驗

儘管DNApolⅠ是第一個被鑒定的DNA聚合酶但它不是在腸桿菌中DNA複製的主要聚合酶主要證據如下:[1]純化的DNApolⅠ催化dNTP摻入的速率為667鹼基/分而體內DNA合成速率要比此高二倍數量級[2]大腸桿菌的一個突變株中此酶的活力正常但染色體DNA複製不正常[3]而在另一些突變株中DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%但是DNA複製卻正常而且此突變株增加了對紫外線烷化劑等突變因素的敏感性這表明該酶與DNA複製關係不大而在DNA修復中起著重要的作用

一些特定的DNA聚合酶對於化學修飾性核苷分子顯示出驚人的耐受性從而為高度功能化的核酸分子的有效合成提供了令人激動的新機遇

4聚合酶-研究成果編輯 聚合酶結構示意圖

新興納米技術的一個誘人之處就是它可以識別核酸是否可作為一種用途多樣的有效實驗平台以應用於建造那些更為複雜的生物醫學工具有多種特定的功能基團能以共價鍵的形式聯接到核苷上而核苷又依次通過幾種化學反應組裝成鏈狀物一方面這是一種耗費勞動的過程但在另一方面一些科學家現在正通過此種過程來檢驗自然產生的酶類是否可以用作一種更為有效的替代物 德國波恩大學的MichaelFamulok就是這樣的研究者他的研究小組已經發表了幾篇文章介紹這種方法的可行性最近他們加大研究力度使用七種不同的細菌性DNA聚合酶系統檢測了包含有酸性鹼性和親脂性之類的不同功能基團的多種核苷分子整合到寡核苷酸鏈的情況一些酶很難對這些異化性底物產生作用但Pwo和Vent這兩種聚合酶則與眾不同它們能有效地將所有能檢測到的核苷變異分子進行有效整合在隨後的實驗中Famulok的研究小組描述了那些可能影響整合效率的模板順序決定簇以這兩個包含所有四種核苷類型變異體的寡核苷酸聚合酶為例證介紹了這些酶的高效合成同時還介紹了為生產功能相近產物而對一種修飾性模板成功進行的PCR擴增

聚合酶分子反應示意圖

這些聚合酶的適應性對於將來開發諸如寡聚核苷酸適配子之類的生化工程產品具有重要的意義Famulok解釋說這種新增化學特性也許能使寡聚核苷酸適配子獲得更多類似於蛋白質的活動特徵而同時並沒有丟失它所擁有的類似核酸方面的優點這對你希望使用寡聚核苷酸適配子作為診斷劑或藥物來說是非常有用的同時他也希望將這種方法應用於有關高次DNA結構的複雜工程問題例如利用那些通過蛋白質交互作用的類似方式能進行自組裝的電荷分佈改變特徵構建修飾性DNA分子雖然這些工作還需要進一步完善但同樣的原理也可以應用到RNA分子的功能化方面為RNA小分子的良性管理提供新的可能Famulok建議你可以將被束縛的鹼基以生化酶的時髦方式引入到RNA小分子中接著試圖通過一個光脈衝或者其它類似的東西激活這個RNA小分子 Famulok最希望他的研究小組能為那些具有創新想法的研究者提供一種有價值的參考他說如果人們想利用功能化的高密度DNA做些事情的話雖然這些新思路我個人目前因為愚鈍還無法想象的話但他們能在我們的論文中找到重要啟發來幫助他們實現夢想

5聚合酶-現狀編輯 顯微鏡下的聚合酶

自然雜誌近日在線發表由中國科學院生物物理研究所研究員劉迎芳領導的研究組和南開大學饒子和院士領導的南開大學清華大學生物物理所聯合研究組共同完成的一項有關禽流感病毒聚合酶結構的研究揭示出流感病毒聚合酶關鍵部分PA亞基與PB1多肽複合體的精細三維結構填補了禽流感病毒聚合酶結構領域研究的空白這一結構的解析為研究禽流感病毒的複製機制以及設計抗流感病毒的藥物提供了真實可用的模型據介紹流感病毒基因組含有8個RNA片段已知可以編碼11種病毒蛋白質其中由PAPB1和PB2這3個亞基組成的聚合酶複合體是負責病毒基因組RNA複製以及病毒mRNA轉錄的關鍵組分同時由於它的高度保守性低突變率成為抗流感病毒藥物設計的重要靶點多年來的研究認為PB1是病毒RNA聚合酶的催化亞基負責病毒RNA的複製以及轉錄PB2是負責以一種稱為Snatch的方式奪取宿主mRNA的CAP帽子結構用於病毒mRNA轉錄而PA亞基不但參與病毒複製過程而且還參與病毒RNA轉錄內切核酸酶活性具有蛋白酶活性以及參與病毒粒子組裝等多種病毒活動過程因而在整個聚合酶複合體的研究中顯得格外重要研究人員利用全新的思路解析了PA與PB1氨基端多肽蛋白複合體的2.9埃解析度晶體結構該結構清晰顯示了PA與PB1多肽相互作用模式發現該作用位點的氨基酸殘基在流感病毒中高度保守這為廣譜抗流感(包括人流感和禽流感)藥物研究提供了一個理想的靶蛋白同時根據該複合體結構以及已知的一些蛋白突變體研究結果推測了PA亞基在聚合酶中的作用為進一步研究提供了分子基礎

迄今為止在真核細胞中已至少發現了12種DNA聚合酶,包括聚合酶αβγδεζηθικλ和μ它們通過參與DNA聚合反應核酸外切酶的校讀作用或DNA修復過程對DNA複製保真度的維持起重要作用直接影響著細胞遺傳穩定


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