組織培養

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植物組織培養概念(廣義)又叫離體培養,指從植物體分離出符合需要的組織。器官細胞原生質體等,通過無菌操作,在人工控制條件下進行培養以獲得再生的完整植株或生產具有經濟價值的其他產品的技術。 植物組織培養概念(狹義)指用植物各部分組織,如形成層。薄壁組織。葉肉組織。胚乳等進行培養獲得再生植株,也指在培養過程中從各器官上產生愈傷組織的培養,愈傷組織再經過再分化形成再生植物。

目 錄1植物組培發展簡史

2植物組培的應用前景

3分類

4步驟

4.1 培養基配製

4.2 滅菌

4.3 接種

4.4 培養

4.5 馴化移栽

5組織培養的優點

6組織培養的應用

7植物組織培養應用

7.1 基本概念

7.2  應用現狀

1植物組培發展簡史植物組織培養與細胞培養開始於19世紀後半葉,當時植物細胞全能性的概念還沒有完全確定,但基於對自然狀態下某些植物可以通過無性繁殖產生後代的觀察,人們便產生了這樣一種想法即能否將植物體的一部分在適當的條件下培養成一個完整的植物體,為此許多植物科學工作者開始了培養植物組織的嘗試。最初的問題仍然是集中在植物細胞有沒有全能性和如何使這種全能性表現出來。

1839年Schwann提出細胞有機體的每一個生活細胞在適宜的外部環境條件下都有獨立發育的潛能。1853年trecul利用離體的莖段和根段進行培養獲得了愈傷組織,愈傷組織是指一種沒有器官分化但能進行活躍分裂的細胞團,但這還不能證明細胞具有全能性,因為由愈傷組織沒能再生出完整植物體。1901年Morgan首次提出一個全能性細胞應具有發育出一個完整植株的能力。所謂全能性細胞就是指具有完整的膜系統和細胞核的生活細胞,在適宜的條件下可通過細胞分裂與分化,再生出一個完整植株。White指出:如果一個給定的有機體的所有細胞都大致相同,並具有全能性,那麼在有機體內所觀察到的細胞分化必定是這些細胞對有機體內微環境和周圍環境的反應。就是說機體內每個細胞所以沒有表現出全能性,是因為該細胞所處位置的不同,致使其某些功能抑制(suppressed),這充分說明機體內的微環境因素在細胞分化中起了十分重要的作用。按照現代發育生物學和細胞生物學的理論,細胞分化是受基因時間和空間兩個方面的調控,空間就是指細胞在機體內所處的位置。不同位置的細胞,其基因的表達不同,細胞所表現出的形態結構和行為就不同。如果將一個生活的細胞從植物體內分離出來,使之脫離開原有的環境,細胞被抑制的功能將有望得以恢復,重新表現出全能性。基於這種認識,科學工作者便萌生出了植物組織培養的念頭。

Haberlandt(1902)首次提出細胞培養的概念,也是第一個用人工培養基對分離的植物細胞進行培養的人。與rechinger不同,Haberlandt相信切塊大小不會影響細胞增殖,但由於Haberlandt使用的培養液成分簡單,培養的細胞是高度分化的細胞,又沒採取消毒技術,所以實驗失敗,培養的細胞雖然存活了幾個月但沒能分裂。Haberlandt轉而對損傷複發興趣,提出激素作用的概念(leptohormone),與維管組織特別是韌皮部有關;另一類是創傷激素(woundhomone),與細胞損傷有關,為後來激素理論的建立和在組織培養中的廣泛應用奠定了基礎。但自Haberlandt的實驗之後直到1934年White培養番茄離體根尖的成功,其間的30多年裡,植物組織培養技術幾乎沒有什麼進展。分析其原因,主要就是培養基的成分和實驗所選取的材料不夠合適。

1934年White用離體的番茄根建立了第一個活躍生長的無性系,使根的離體培養實驗首次獲得了真正的成功,並首次發現和提出B族維生素B1、維生素B6煙酸的重要性。與此同時,Cautheret在山毛柳和黑楊形成層組織的培養中也發現了B族維生素的作用,並使培養獲得了成功。Nobecourt也用胡蘿蔔建立了類似的連續生長的組織培養物。因此,Haberlandt、White和Nobecourt一起被譽為植物組織培養的奠基人。人們現在所用的若干培養方法和培養基,原則上都是他們在1939年所建立的方法和培養基演變的結果,幾乎所有的培養基中都添加了不同種類和不同數量的B族維生素。從此植物組織培養XX快速發展時期。1941年,Overbeek、Conklin和Blakeslee等用附加椰乳到培養基中,獲得了Datura離體胚培養的成功。椰乳成分複雜,含有多種不同的有機物,後來的研究發現,其中在組織培養中起主要作用的是腺嘌呤類激素或類似物。1944年,Skoog報道DNA的降解產物腺嘌呤和腺苷可以促進愈傷組織的生長,解除生長素對芽形成的抑製作用,誘導芽的形成。1948年,Caplin和Steward用實驗證明椰乳與2,4-D配合,對培養的胡蘿蔔和馬鈴薯組織的增殖起到明顯的促進作用。在用煙草髓細胞誘導愈傷組織的實驗中,Skoog,Miller等分離確定了6-呋喃氨基嘌呤對細胞分裂有促進作用,並命名為「激動素」(Kinetin)。之後,與此相關的同系物6-苄氨基嘌呤被合成,它也刺激培養物的細胞分裂。於是,出現了「細胞分裂素」這一集合名詞,專門用來指能刺激培養物細胞分裂的一組6-某基團的氨基嘌呤化合物。爾後,玉米素、異戊烯基腺嘌呤和其他細胞分裂素等植物激素的相繼發現,更增加了細胞分裂素的種類。由於發現生長素和細胞分裂素相互配合能調節細胞的分裂與分化,控制器官的分化,生長素高時可誘導根的形成,細胞分裂素高時可促進芽的分化,使植物組織培養的工作迅速取得突破。1958年美國的Steward和德國的Reinert分別由培養的胡蘿蔔細胞誘導形成了胚狀體,1965年由Vasil和Hildebrandt用單個分離的細胞培養獲得整個植株的再生,從而使植物細胞全能性的理論真正得到了科學的證實。從此之後,一批又一批植物的組織或器官通過培養的方法獲得了再生植株。

20世紀60年代,在植物組織培養方面的另外兩項成就就是劃分小孢子培養和原生質體培養的成功。Guha和Maheshwari(1966,1967),Rourgin和Nitsch(1967)先後利用煙草和胡蘿蔔的小孢子培養獲得單倍體植株,並成功地實現了染色體的加倍,使這種同源二倍體植株在5個月內收穫到種子。Cocking等用純化的纖維素酶果膠酶處理煙草細胞,獲得原生質體,通過調節滲透壓的方法控制原生質體膨脹,使培養獲得成功,得到了再生植株。自20世紀60年代始,植物組織與細胞培養逐漸走向了工廠化和商品化階段。

現在已不能確切統計有多少種植物通過組織培養的方法獲得了再生植株,因為幾乎每天都有可能出現利用新的植物種類獲得培養成功的報道。植物組織培養已經變成了一種常規的實驗技術,廣泛應用於植物的脫毒、快繁、基因工程細胞工程遺傳研究、次生代謝物質的生產、工廠化育苗等多個方面;從高級的研究機構、大專院校到普通的生物技術公司,甚至農民專業戶都在不同程度的利用或開展組織培養工作。

植物組織培養已經走過了近百年的歷程。它的歷史不僅證明了植物的每一個生活細胞都含有一種植物的全部遺傳信息,在一定的條件下可以發育成一個完整的植株,而且在一定範圍內人們可以按照意願,改變和調節植物的發育。但這種調節和改變知識局部的,主要是通過改變培養基中的激素和培養條件,從遺傳基礎上的徹底改造僅僅是開始。但是,生命的奧秘是很深遠的,植物也如此,科學家至今仍不能實現對所有植物的組織培養再生,對基因型對組培成功的影響至今仍迷惑不解,而且對已經獲得成功的植物,也還是有很多問題沒有解決。即便像煙草和擬南芥這樣的模式植物,也沒能實現讓它們在組培容器中遂願的生長發育和開花結實。人們對植物的認識、了解和掌握,仍然處於必然王國階段,單就其組織培養而言,還有十分漫長的道路要走。

2植物組培的應用前景1.快速繁殖某些稀有植物或有較大經濟價值的植物 依靠自然條件在較短時間內繁殖稀有植物和經濟價值較高的植物,受到地理環境和季節的限制,很難達到快速、高效的目的;特別對於在短時期內需要達到一定數量,才能創造應有價值的植物,時間就是效益,只有通過組織培養的方法才能滿足這一要求。

用組織培養法繁殖植物,這是組織培養應用於生產的主要的和成效最大的實例。首先是在蘭花上的成功應用。自Morel在1960年得到蘭花組織培養苗后,很快應用於生產,形成了組織培養法繁殖蘭花工業。

由於組織培養法繁殖植物的明顯特點是快速,每年可以數以百萬倍速度繁殖,因此對一些繁殖係數低,不能用種子繁殖的名特優植物品種的繁殖,尤為意義重大。

2、脫毒 植物中有很多都帶有病毒,嚴重影響植物的產量和品質,給農業帶來災害。特別是無性繁殖植物,如馬鈴薯、草莓大蒜康乃馨等,由於病毒是通過維管束傳導的,因此利用這些植物營養器官繁殖,就會把病毒帶到新的植物個體上而發生病害。但是也證明感病植株並不是每個部位都帶有病毒,如莖尖生長點尚未分化成維管束的部分,可能不帶病毒。若利用組織培養法進行莖尖培養,再生的植株有可能不帶病毒,從而獲得脫病毒的苗,再用這種苗進行繁殖,則種植的植物就不會或極少發生病毒病

所獲得的脫毒苗一定要經過鑒定,確認不帶病毒才能使用。使用組織培養法獲得脫毒苗已經在草莓、葡萄、康乃馨等獲得成功,產生明顯的經濟效應

3、植物種質資源的保存、挽救瀕於滅絕的植物 長期以來人們想了很多方法來保存植物,如儲存果實,儲存種子,儲存塊根塊莖、種球、鱗莖;用常溫、低溫、變溫、低氧、充惰性氣體等,這些方法在一定程度上收到了好的或比較好的效果,但仍存在許多問題。主要問題是付出的代價高,占的空間大,保存時間短,而且易受環境條件的限制。植物組織培養結合超低溫保存技術,可以給植物種質保存帶來一次大的飛躍。因為保存一個細胞就相當與保存一粒種子,但所占的空間僅為原來的幾萬分之一,而且在-193度的液氮中可以長時間保存,不像種子那樣需要年年更新或經常更新。

環境的不斷變化使許多種類的植物面臨著滅絕的危險,而且許多種植物已經滅絕,留給人類的只是一種遺憾。如何挽救這些植物,還有許許多多的動物,已成為世人關注的問題。實踐證明,通過組織培養的方法可以使一部分瀕危的植物種類得到延續和保存;如果在結合超低溫保存技術,就可以使這些植物得到較為永久性的保存。其實,對大多數普通植物來說,用組織培養的方法保存其種質材料,也具有十分重要的意義。因為,人們現在無法預知哪些植物會面臨滅頂之災,或許今天看似繁茂的植物,明天就可能被沙漠、洪水、大火或戰爭吞沒。

4、通過花藥和花粉培養獲得單倍體植株、縮短育種年限 通過花藥和花粉組織培養可以獲得單倍體植物,大大縮短了育種時間。使新品種的培育過程大大簡化

5、胚胎培養的應用 在遠源雜交中,雜交后形成的胚珠往往在未成熟狀態時,就停止生長,不能形成有生活力的種子,因而雜交不孕,這給遠緣雜交造成極大困難。十九世紀二十年代末,Laibach用胚培養技術培養亞麻種間雜種胚,第一個獲得了雜種植物,這一成功為在遠緣時克服雜交不親和的障礙提供了一項有用的技術。

這項技術發展至今,已經相當成熟,可以說多數植物的成熟或未成熟胚通過培養都可獲得成功。幼胚培養已經可使5個細胞大小的極幼齡的胚狀結構培養成植株。但胚珠培養的研究不多,單個胚珠培養尚存在許多問題,需作深化研究。

遠緣雜交中,由於生理上和遺傳上的障礙而不能雜交成功,可採用試管XX加以克服,即將母本胚珠離體培養,使異種花粉在胚珠上萌發XX,產生的雜種胚在試管中發育成完整植株。

用胚乳培養可獲得三倍體植株,為誘導形成三倍體植物開闢了一條新途徑。三倍體加倍后得到六倍體,可育成多倍體品種。

6、細胞融合通過原生質體融合,可部分克服有性雜交不親和性,而獲得體細胞雜種,從而創造新種或育成優良品種。

7、培養細胞突變體的應用 培養細胞處在不斷分生狀態,它就容易受培養條件和外加壓力(如XX線、化學物質)的影響而產生突變,從中可以篩選出有用的突變體,從而育成新品種。目前用這種方法已經篩選到抗病、抗鹽、高蛋白、高產等突變體,有些已經用於生產。

8、用於遺傳學分子生物學細胞生物學、組織學、胚胎學、基因工程、生物工程等地研究要揭開生命活動的秘密,需要多科學、多技術的相互配合,其中植物組織培養技術是不可缺少的,它為遺傳學、分子生物學、細胞生物學、生物工程等提供了一種有效、快速的方法。因為要揭示生命的奧秘,首先要研究單個基因的作用,研究它在細胞內是如何組裝的,如何與其它基因發生聯繫,如何表達和調控等。分離單個基因,對它DNA進行測序,再對其中的某些鹼基實行突變,然後還需要將基因送到受體細胞當中,看表達情況,以確定其功能。接受基因的受體細胞要產生再生植株,就需要通過組織培養的方法才能實現。

9、利用組織培養的材料作為植物生物反應器中國的中草藥是一份人類寶貴的財富,但很多種中草藥資源匱乏,產量不足,甚至瀕於滅絕。如果能利用組織和細胞培養的方法在實驗室內生產,不再依附於自然環境,不僅可以解決現有困難,而且可以通過篩選高產有效成分的細胞系,來提高其藥用價值。比如用培養的人蔘懸浮細胞,來生產人蔘皂苷,已在日本等國家形成規模。利用培養的植物細胞和組織細胞作為生物反應器,也可以生產某些蛋白質氨基酸抗生素、疫苗等,如用生食蔬菜生產乙肝疫苗正在實驗中。

10、用於其它未知科學的研究 現代科學發展非常迅速,很多現在預想不到的事情都有可能發生,新發明、新發現、新創造層出不窮,今天認為不可能的東西明天就可能變成現實。植物組織培養也同樣具有許多尚未發掘出的潛力,說不定有一天人們會在三角瓶內種出大南瓜

總之,現在的植物組織培養仍然處於發展階段,遠遠沒有達到它的高峰期,很多機理人們還沒有搞清楚,它的潛力還遠遠沒有發揮出來。相信在今後的幾十年內,組織培養將會有更大的發展,在農業、製藥業、加工業等方面將會發揮更大的作用,創造出更大的經濟效益。

3分類按外植體分,植物組織培養可分以下幾類:1、胚胎培養植物的胚胎培養,包括胚培養、胚乳培養、胚珠和子房培養,以及離體XX的胚胎培養技術等。2、器官和組織培養器官培養是指植物某一器官的全部或部分或器官原基的培養,包括莖段、莖尖、塊莖、球莖、葉片、花序、花瓣、子房、花藥、花托、果實、種子等。組織培養有廣義和狹義之分。廣義:包括各種類型外植體的培養。狹義:包括形成層組織、分生組織、表皮組織、薄壁組織和各種器官組織,以及其培養產生的愈傷組織。3、細胞培養細胞培養包括利用生物反應器進行的,旨在促進細胞生長和生物合成的大量培養系統和利用單細胞克隆技術促進細胞生長、分化直至形成完整植株的單細胞培養。4、原生質體培養植物原生質體是被去掉細胞壁的由質膜包裹的、具有生活力的裸細胞。

4步驟培養基配製配製培養基有兩種方法可以選擇,一是購買培養基中所有化學藥品,按照需要自己配製;二是購買商品的混合好的培養基基本成分粉劑,如MS、B5等。

自己配製可以節約費用,但浪費時間、人力、且有時由於藥品的質量問題,給實驗帶來麻煩。就目前國內的情況看,大部分還是自己配製。為了方便起見,現以MS培養基為例介紹配置培養基的主要過程。

1.配製幾種母液

1.配製MS大量元素母液

一般將大量元素分別配製成100倍的母液,使用時再分別稀釋100倍。

分別稱取

NH4NO3 165g KH2PO4 17g

KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g

MgSO4·7H2O 37g

各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中。

2.配製MS微量元素母液

一般將微量元素配製成100倍母液。

依次稱取

KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g

H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g

MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g

ZnSO4·7H2O 0.86g

配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由於稱取量很小,如果天平精確度沒有達到萬分之一,可先配成調整液。

分別稱取

CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g

各自配成100ml的調整液,然後取5ml就還有0.0025g的量。

3.配製MS有機母液

一般配製成100倍MS有機母液。

依次稱取

肌醇 10g 鹽酸硫胺素(VB1) 0.01g

煙酸 0.05g 甘氨酸 0.2g

鹽酸吡哆醇(VB6) 0.05g

配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中。

4.配製MS鐵鹽母液

一般配製成100倍MS鐵鹽母液。

依次稱取

EDTA二鈉3.73g FeSO4·7H2O2.78g

配成1L母液,倒入1L試劑瓶中,存放于冰箱中。

所以MS母液有5種大量元素母液,加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液,共8種母液。

激素母液的配製

各種生長素和細胞分裂素要單獨配製,不能混合在一起,生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解,細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解,然後再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2.配製培養基

以配置1L MS培養基為例,按順序進行如下操作:

1.先在燒杯中放入一些蒸餾水。

2.分別取上面八種母液10ml倒入。

3.一般稱取30g蔗糖倒入,攪拌溶解。

4.加蒸餾水用量筒定溶至1L。

5.按設計好的方案添加各種激素,由於激素的用量很小,而且激素對組培植物的生長至關重要。所以有條件的話最好用微量可調移液器吸取,減少誤差。

6.用精密試紙或酸度計調整PH至5.7~5.8。(有條件的話使用酸度計,比較精確) 可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來調溶液PH值。

1當量HCL配製:用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

1當量NaOH配製:稱取NaOH 4g 配成100ml溶液。

7.稱取5g左右瓊脂粉(質量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中,放在電爐上加熱至沸騰,直到瓊脂粉熔化。

8.稍微冷卻后,分裝入培養容器中。無蓋的培養容器要用封口膜或牛皮紙封口,用橡皮筋或繩子紮緊。

9.放入消毒滅菌鍋滅菌,滅菌20分鐘左右。

10.滅菌后從滅菌鍋中取出培養基,平放在實驗台上令其冷卻凝固。

滅菌滅菌是組織培養重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的範疇。有菌的範疇是:凡是暴露在空氣中的物體,接觸自然水源的物體,至少它的表面都是有菌的。依此觀點,無菌室等未處理的地方、超凈台的表面、簡單煮沸的培養基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內表,如整個消化道呼吸道,即我們呼出的氣體、培養容器無論洗得多乾淨等等都是有菌的。

這裡所指的菌,包括細菌真菌放線菌藻類及其他微生物。菌的特點是:極小,肉眼看不見。無處不在,無時不有,無孔不入。在自然條件下忍耐力強,生活條件要求簡單,繁殖力極強,條件適宜時便可大量滋生。

無菌的範疇是:經高溫灼燒或一定時間蒸煮過後的物體,經其他物理或化學的滅菌方法處理后的物體(當然這些方法必須已經證明是有效的),高層大氣、岩石內部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內部,強酸強鹼,化學元素滅菌劑等表面和內部都是無菌的。從以上可以看出:在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。

滅菌是指用物理或化學的方法,殺死物體表面和孔隙內的一切微生物或生物體,即把所有生命的物質全部殺死。與此相關的一個概念是消毒,它指殺死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再發生危害作用,顯然經過消毒,許多細菌芽孢黴菌厚垣孢子等不會完全殺死,即由於在消毒后的環境里和物品上還有活著的微生物,所以通過嚴格滅菌的操作空間(接種、超凈台等)和使用的器皿,以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作,就叫做無菌操作

植物組織培養對無菌條件的要求是非常嚴格的,甚至超過微生物的培養要求,這是因為培養基含有豐富的營養,稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的,必鬚根據不同的對象採取不同的切實有效的方法滅菌,才能保證培養時不受雜菌的影響,使試管苗能正常生長。

常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類,即:物理方法如乾熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、XX線處理(紫外線超聲波微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施;化學方法是使用升汞、甲醛過氧化氫高錳酸鉀來蘇水漂白粉次氯酸鈉抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。

1.培養基用濕熱滅菌

培養基在製備后的24小時內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是:在密閉的蒸鍋內,其中的蒸汽不能外溢,壓力不斷上升,使水的沸點不斷提高,從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下,鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下,可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。

注意完全排除鍋內空氣,使鍋內全部是水蒸氣,滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法,但目的都是要排凈空氣,使鍋內均勻升溫,保證滅菌徹底。常用方法是:關閉放氣閥,通電后,待壓力上升到0.05MPa時,打開放氣閥,放出空氣,待壓力表指針歸零后,再關閉放氣閥。

關閥再通電后,壓力表上升達到0.1MPa時,開始計時,維持壓力0.1~0.15MPa,20分鐘。

按容器大小不同,保壓時間有所不同,見表。該表所列數字是徹底滅菌很保險的數字,如果容器體積較大,但是放置的數量很少,也可以減少時間。

接種接種時由於有一個敞口的過程,所以是極易引起污染的時期,這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起,接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內保持定期用1%~3%的高錳酸鉀溶液對設備、牆壁、地板等進行搽洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外,還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧,使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行:

1.在接種4小時前用甲醛熏蒸接種室,並打開其內紫外線燈進行殺菌

2.在接種前20分鐘,打開超凈工作台的風機以及台上的紫外線燈;

3.接種員先洗凈雙手,在緩衝間換好專用實驗服,並換穿拖鞋等;

4.上工作台後,用酒精棉球搽拭雙手,特別是指甲處。然後搽拭工作檯面;

5.先用酒精棉球搽拭接種工具,再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍,然後反覆過火尖端處,對培養皿要過火烤乾;

6.接種時,接種員雙手不能離開工作台,不能說話、走動和咳嗽等;

7.接種完畢后要清理乾淨工作台,可用紫外線燈滅菌30分鐘,若連續接種,每5天要大強度滅菌一次。

接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官,經切割或剪裁成小段或小塊,放入培養基的過程。現將接種前後的程序連貫地介紹。

無菌接種步驟:

1.將初步洗滌及切割的材料放入燒杯,帶入超凈台上,用消毒劑滅菌,再用無菌水沖洗,最後瀝去水分,取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。

2.材料吸干后,一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀,對材料進行適當的切割。如葉片切成0.5cm平方的小塊;莖切成含有一個節的小段。微莖尖要剝成只含1~2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經常灼燒接種器械,防止交叉污染。

3.用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養基上。具體操作過程(以試管為例)是:先解開包口紙,將試管幾乎水平拿著,使試管口靠近酒精燈火焰,並將管口在火焰上方轉動,使管口裡外灼燒數秒鐘。若用棉塞蓋口,可先在管口外面灼燒,去掉棉塞,再燒管口裡面。然後用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內,輕輕XX培養基上。若是葉片直接附在培養基上,以放1~3塊為宜。至於材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外,其他尚無統一要求。接種完后,將管口在火焰上再灼燒數秒種。並用棉塞,塞好后,包上包口紙,包口紙裡面也要過火。

培養培養指把培養材料放在培養室(有光照、溫度條件、無菌)里,使之生長,分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。

1.培養方法

1.固體培養法

即用瓊脂固化培養基來培養植物材料的方法。是現在最常用的方法。雖然該方法設備簡單,易行,但養分分佈不均,生長速度不均衡,並常有褐化中毒現象發生。

2.液體培養法

即用不加固化劑的液體培養基培養植物材料的方法。由於液體中氧氣含量較少,所以通常需要通過攪動或振動培養液的方法以確保氧氣的供給,採用往複式搖床或旋轉式搖床進行培養,其速度一般為50~100r/min,這種定期浸沒的方法,既能使培養基均一,又能保證氧氣的供給。

2.培養步驟

1.初代培養

初代培養旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后,最初的幾代培養。初代培養時,常用誘導或分化培養基,即培養基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養建立的無性繁殖系包括:莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據初代培養時發育的方向可分為:

1)頂芽和腋芽的發育

採用外源的細胞分裂素,可促進使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側芽啟動生長,從而形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結構。在幾個月內可以將這種叢生苗的一個枝條轉接繼代,重複芽苗增殖的培養,並且迅速獲得多數的嫩莖。然後將一部分嫩莖轉移到生根培養基上,就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少數草本植物也可以通過這種方式來進行再生繁殖,如月季茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型繁殖,它不經過發生愈傷組織而再生,所以是最能使無性系後代保持原品種的一種繁殖方式。

適宜這種再生繁殖的植物,在採樣時,只能採用頂芽、側芽或帶有芽的莖切段,其他如種子萌發后取枝條也可以。

莖尖培養可看作是這方面較為特殊的一種方式。它採用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進行接種。在實際操作中,採用包括莖尖分生組織在內的一些組織來培養,這樣便保證了操作方便以及容易成活

用靠培養定芽得到的培養物一般是莖節較長,有直立向上的莖梢,擴繁時主要用切割莖段法,如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽,形成芽叢。

2)不定芽的發育

在培養中由外植體產生不定芽,通常首先要經脫分化過程,形成愈傷組織的細胞。然後,經再分化,即由這些分生組織形成器官原基,它在構成器官的縱軸上表現出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數情況下它形成芽,后形成根。

另一種方式是從器官中直接產生不定芽,有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當在試管培養的條件下,培養基中提供了營養,特別是提供了連續不斷植物激素的供應,使植物形成不定芽的能力被大大地激發起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規方法中不能無性繁殖的種類,在試管條件下卻能較容易地產生不定芽而再生,如柏科,松科,銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發生不定芽,用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。

在不定芽培養時,也常用誘導或分化培養基。用靠培養不定芽得到的培養物,一般採用芽叢進行繁殖,如非洲菊、草莓等。

3)體細胞胚狀體的發生與發育

體細胞胚狀體類似於合子胚但又有所不同,它也通過球形,心形,魚雷形和子葉形的胚胎髮育時期,最終發育成小苗。但它是由體細胞發生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產生,也可從外植體表面已分化的細胞中產生,或從懸浮培養的細胞中產生。

4)初代培養外植體的褐變

外植體褐變是指在接種后,其表面開始褐變,有時甚至會使整個培養基褐變的現象。它的出現是由於植物組織中的多酚氧化酶被激活,而使細胞的代謝發生變化所致。在褐變過程中,會產生醌類物質,它們多呈棕褐色,當擴散到培養基后,就會抑制其他酶的活性,從而影響所接觸外植體的培養。

褐變的主要原因如下:

a、植物品種 研究表明,在不同品種間的褐變現象是不同的。由於多酚氧化酶活性上的差異,因此,有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變,而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此,在培養過程中應該有所選擇,對不同的品種分別進行處理。

b、生理狀態由於外植體的生理狀態不同,所以在接種后褐變程度也有所不同。一般說來,處於幼齡期的植物材料褐變程度較淺,而從已經成年的植株採收的外植體,由於含醌類物質較多,因此褐變較為嚴重。一般來說,幼嫩的組織在接種后褐變程度並不明顯,而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。

c、培養基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加,此外,細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性,從而使褐變現象加深。

d、培養條件不當 如果光照過強、溫度過高、培養時間過長等,均可使多酚氧化酶的活性提高,從而加速被培養的外植體的褐變程度。

為了提高組織培養的成苗率,必須對外植體的褐變現象加以控制。可以採用以下措施防止、減輕褐變現象的發生。

1.選擇合適的外植體 一般來說,最好選擇生長處於旺盛的外植體,這樣可以使褐變現象明顯減輕。

2.合適的培養條件 無機鹽成分、植物生長物質水平、適宜溫度、及時繼代培養均可以減輕材料的褐變現象。

3.使用抗氧化劑 在培養基中,使用半胱氨酸抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現象。另外,使用0.1%~0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。

4.連續轉移 對容易褐變的材料可間隔2~24小時的培養后,再轉移到新的培養基上,這樣經過連續處理7~10天後,褐變現象便會得到控制或大為減輕。

(2)繼代培養

在初代培養的基礎上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等,數量都還不夠,它們需要進一步增殖,使之越來越多,從而發揮快速繁殖的優勢。

繼代培養是繼初代培養之後的連續數代的擴繁殖培養過程。旨在繁殖出相當數量的無根苗,最後能達到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養的後代是按幾何級數增加的過程。如果以2株苗為基礎,那麼經10代將生成210株苗。

繼代培養中擴繁的方法包括:切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用於有伸長的莖梢、莖節較明顯的培養物。這種方法簡便易行,能保持母種特性。培養基常是MS基本培養基;分離芽叢適於由愈傷組織生出的芽叢。培養基常是分化培養基。若芽叢的芽較小。可先切成芽叢小塊,放入MS培養基中,待到稍大時,再分離開來繼續培養。

增殖使用的培養基對於一種植物來說每次幾乎完全相同,由於培養物在接近最良好的環境條件,營養供應和激素調控下,排除了其他生物的競爭,所以能夠按幾何級數增殖。

在快速繁殖中初代培養只是一個必經的過程,而繼代培養則是經常性不停的進行過程。但在達到相當數量之後,則應考慮使其中一部分轉入生根階段。從某種意義上講,增殖只是儲備母株,而生根才是增殖材料的分流,生產出成品。

3.繼代培養時材料的玻璃化

實踐表明,當植物材料不斷地進行離體繁殖時,有些培養物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水跡狀,這種想象通常稱為玻璃化。它的出現會使試管苗生長緩慢、繁殖係數有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調症。

因為出現玻璃化的嫩莖不宜誘導生根,因此,使繁殖係數大為降低。在不同的種類、品種間,試管苗的玻璃化程度也有所差異。當培養基上細胞分裂素水平較高時,也容易出現玻璃化現象。在培養基中添加少量聚乙烯醇脫落酸等物質,能夠在一定程度上減輕玻璃化的現象發生。

呈現玻璃化的試管苗,其莖、葉表面無蠟質,體內的極性化合物水平較高,細胞持水力差,植株蒸騰作用強,無法進行正常移栽。這種情況主要是由於培養容器中空氣濕度過高,透氣性較差造成的,其具體解決的方法為:

a、增加培養基中的 溶質水平,以降低培養基的水勢

b、減少培養基中含氮化合物的用量;

c、增加光照

d、增加容器通風,最好進行CO2施肥,這對減輕試管苗玻璃化的現象有明顯的作用;

e、降低培養溫度,進行變溫培養,有助於減輕試管苗玻璃化現象發生;

f、降低培養基中細胞分裂素含量,可以考慮加入適量脫落酸。

3.生根培養

當材料增殖到一定數量后,就要使部分培養物分流到生根培養階段。若不能及時將培養物轉到生根培養基上去,就會使久不轉移的苗子發黃老化,或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費。根培養是使無根苗生根的過程,這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養可採用1/2或者1/4MS培養基,全部去掉細胞分裂素,並加入食糧非的生長素(NAA、IBA等)。

誘導生根可以採用下列方法

a、將新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中處理4~8小時;

b、在含有生長素的培養基中培養4~6天

c、直接移入含有生長素的生根培養基中。

上述三種方法均能誘導新梢生根,但前兩種方法對新生根的生長發育則更為有利。而第三種對幼根的生長有抑製作用。其原因是當根原始體形成后較高濃度生長素的繼續存在,則不利於幼根的生長發育。不過這種方法比較可行。

另外也可採用下列方法就可生根。1、延長在增殖培養基中的培養時間;2、有意降低一些增殖倍率,減少細胞分裂素的用量(即將增殖與生根合併為一步);3、切割粗壯的嫩枝在營養缽中直接生根,此方法則沒有生根階段。可以省去一次培養基製作,切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理,但這種方法只適於一些容易生根的作物。

另外少數植物生根比較困難時,則需要在培養基中放置濾紙橋,使其略高於液面,靠濾紙的吸水性供應水和營養,從而誘發生根。

從胚狀體發育成的小苗,常常有原先已分化的根,這種根可以不經誘導生根階段而生長。但因經胚狀體發育的苗數特別多,並且個體較小,所以也常需要一個低濃度或沒有植物激素的培養基培養的階段,以便壯苗生根。

試管內生根壯苗的階段,為了成功地將移植到試管外的環境中,以使試管苗適應外界的環境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花,以18~20℃為宜。實踐證明植物生長的溫度過高不但會牽涉到蒸騰加強。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長遲緩,或不易成活。春季低溫時苗床可加設電熱線,使基質溫度略高於氣溫2~3℃,這不但有利於生根和促進根系發達,而且有利於提前成活。

移植到試管外的植物苗光強度應比移植前培養有所提高,並可適應強度較高的漫XX光,(約4000lx左右),以維持光合作用所需光照強度。但光線過強刺激蒸騰加強,會使水分平衡的矛盾更尖銳。

馴化移栽試管苗移栽是組織培養過程的重要環節,這個工作環節做不好,就會造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽,應該選擇合適的基質,並配合以相應的管理措施,才能確保整個組織培養工作的順利完成。

試管苗由於是在無菌、有營養供給、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環境條件下生長的,因此,在生理、形態等方面都與自然條件生長的小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗,例如通過控水、減肥增光、降溫等措施,使她們逐漸地適應外界環境,從而使生理、形態、組織上發生相應的變化,使之更適合於自然環境,只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。

從葉片上看,試管苗的角質層不發達,葉片通常沒有表皮毛,或僅有較少表皮毛,甚至葉片上出現了大量的水孔,而且,氣孔的數量、大小也往往超過普通苗。由此可知,試管苗更適合於高濕的環境生長,當將它們移栽到試管外環境時,試管苗失水率會很高,非常容易死亡。因此,為了改善試管苗的上述不良生理、形態特點,則必須經過與外界相適應的馴化處理,通常採取的措施有:對外界要增加濕度、減弱光照;對試管內要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。

另外,對栽培馴化基質要進行滅菌是因為試管苗在無菌的環境中生長,對外界細菌、真菌的抵禦能力極差。為了提高其成活率,在培養基質中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200~500倍液,以進行滅菌處理。

1.移栽用基質和容器

適合於栽種試管苗的基質要具備透氣性、保濕性和一定的肥力,容易滅菌處理,並不利於雜菌滋生的特點,一般可選用珍珠岩蛭石、砂子等。為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時需按比例搭配,一般用珍珠岩、蛭石、草炭土或腐殖土比例為1:1:0.5。也可用砂子:草炭土或腐殖土為1:1。這些介質在使用前應高壓滅菌。或用至少小時烘烤來消滅其中的微生物。要根據不同植物的栽培習性來進行配製,這樣才能獲得滿意的栽培效果。以下介紹幾種常見的試管苗栽培基質。

1.河砂

河砂分為粗砂、細砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂,其顆粒直徑為1~2mm。細砂即通常所說的面砂,其顆粒直徑為0.1~0.2nm。河砂的特點是排水性強,但保水蓄肥能力較差,一般不單獨用來直接栽種試管苗。

2.草炭土

草炭土是由沉積在沼澤中的植物殘骸經過長時間的腐爛所形成,其保水性好,蓄肥能力強,呈中性或微酸XX,但通常不能單獨用來栽種試管苗,宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以使用。

3.腐殖土

腐殖土是由植物落葉經腐爛所形成。一種是自然形成,一種是人為造成,人工製造時可將秋季的落葉收集起來,然後埋入坑中,灌水保濕的條件下使其風化,然後過篩即可獲得。腐葉上含有大量的礦質營養、有機物質,它通常不能單獨使用。摻有腐殖土的栽培基質有助於植株髮根。

4.容器

栽培容器可用6×6cm~10×10cm的軟塑料缽,也可用育苗盤。前者佔地大,耗用大量基質,但幼苗不用移栽,後者需要二次移苗,但省空間、省基質。

2.移栽前的準備

移栽前可將培養物不開口移到自然光照下鍛煉2-3天,讓試管苗接受強光的照XX,使其長得壯實起來,然後再開口練苗1-2天,經受較低濕度的處理,以適應將來自然濕度的條件。

3.移栽和幼苗的管理

從試管中取出髮根的小苗,用自來水洗掉根部粘著的培養基,要全部除去,以防殘留培養基滋生雜菌。但要輕輕除去,應避免造成傷根。移植時用一個筷子粗的竹籤在基質中插一小孔,然後將小苗XX,注意幼苗較嫩,防止弄傷,栽后把苗周圍基質壓實,栽前基質要澆透水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環境中。保證空氣濕度達90%以上。

1.保持小苗的水分供需平衡。在移栽后5~7天內,應給予較高的空氣濕度條件,使葉面的水分蒸發減少,盡量接近培養瓶的條件,讓小苗始終保持挺拔的狀態。保持小苗水分供需平衡首先營養缽的培養基質要澆透水,所放置的床面也要澆濕,然後搭設小拱棚,以減少水分的餓蒸發,並且初期要常噴霧處理,保持拱棚薄膜上有水珠出現。當5~7天後,發現小苗有生長趨勢,可逐漸降低濕度,減少噴水次數,將拱棚兩端打開通風,使小苗適應濕度較小的條件。約15天以後揭去拱棚的薄膜,並給予水分控制,逐漸減少澆水,促進小苗長得粗壯。

2.防止菌類滋生。由於試管苗原來的環境是無菌的,移出來以後難以保持完全無菌,因此,應盡量不使菌類大量滋生,以利成活。所以應對基質進行高壓滅菌或鴻烤滅菌。可以適當使用一定濃度的殺菌劑以便有效的保護幼苗,如多菌靈、托布津,濃度800~1000倍,噴葯宜7~10天一次。在移苗時盡量少傷苗,傷口過多,根損傷過多,都是造成死苗的原因。噴水時可加入0.1%的尿素,或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥,可加快苗的生長與成活。

3.一定的溫、光條件。試管苗移栽以後要保持一定的溫光條件,適宜的生根溫度是18~20℃,冬春季地溫較低時,可用電熱線來加溫。溫度過低會使幼苗生長遲緩,或不易成活。溫度過高會使水分蒸發,從而使水分平衡受到破壞,並會促使菌類滋生。

另外在光照管理的初期可用較弱的光照,如在小拱棚上加蓋遮陽網或報紙等,以防陽光灼傷小苗和增加水分的蒸發。當小植株有了新的生長時,逐漸加強光照,後期可直接利用自然光照。促進光合產物的積累,增強抗性,促其成活。

4.保持基質適當的通氣性。要選擇適當的顆粒狀基質,保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多,過多的水應迅速瀝除,以利根系呼吸。

綜上所述,試管苗在移栽的過程中,只要把水分平衡、適宜的介質、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好,試管苗是很容易移栽的。

5組織培養的優點可以在不受植物體其它部分干擾下研究被培養部分的生長和分化的規律,並且可以利用各種培養條件影響它們的生長和分化,以解決理論上和生產上的問題。

有力地推動了生物科學中植物生理學生物化學、遺傳學、細胞學、形態學以及農、林、醫、葯等各門學科的發展和相互滲透,促進了營養生理、細胞生理和代謝、生物合成、基因轉移基因重組的研究。

當前組織培養[1]作為生物工程的一項重要技術,在基礎理論研究和生產實踐中發揮的作用與日俱增,可望為造福人類作出貢獻。

6組織培養的應用(一)無性系的快速繁殖:蘭花、甘蔗和名貴品種的無性繁殖;

(二)培育無病毒種苗:馬鈴薯、香蕉蘋果、甘蔗、葡萄、桉樹、毛白楊、草莓、甜瓜、花卉;

(三)新品種的選育

1.花培和單倍體育種;

2.離體胚培養和雜種植株獲得;

3.體細胞誘變和突變體篩選;

4.細胞融合和雜種植株的獲得;

(四)人工種子和種質保存

(五) 次生物質工業化生

7植物組織培養應用自哈布蘭特( G. Haberlandt ) 提出細胞全能性理論在無數科學家的努力下以及進行離體培養以來, 經過80多年的歷程,才使這項技術趨於完善,趨於成熟.近40 年來,植物組織培養技術得到了迅速發展,已滲透到植物生理學、病理學藥學、遺傳學、育種以及生物化學等各個研究領域, 成為生物學科中的重要研究技術和手段之一. 並廣泛應用於農業、林業、工業、醫藥業等多種行業, 產生了巨大的經濟效益和社會效益, 已成為當代生物科學中最有生命力的一門學科.

基本概念植物組織培養是指在無菌條件下, 將離體的植物器官( 如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等)、組織( 如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細胞( 如體細胞、XX細胞等)、胚胎( 如成熟和未成熟的胚)、原生質體( 如脫壁后仍具有生活力的原生質體),培養在人工配製的培養基上, 給予適宜的培養條件, 誘發產生愈傷組織, 或潛伏芽等, 或長成完整的植株, 統稱為植物組織培養. 由於是在試管內培養, 而且培養的是脫離植株母體的培養物, 因此也稱離體培養或試管培養. 根據外植體來源和培養對象的不同, 又分為植株培養、胚胎培養、器官培養、組織培養、原生質體培養等.

 應用現狀2. 1 在植物育種上的應用

目前, 國內外把植物組織培養已普遍應用於作物育種, 並在以下幾個方面取得了較大進展:

( 1) 單倍體育種  單倍體植株往往不能結實, 在培養中用秋水仙素處理, 可使染色體加倍, 成為純合二倍體植株, 這種培養技術在育種上的應用稱為單倍體育種. 單倍體育種具有高速、高效率、基因型一次純合等優點, 因此, 通過花藥或花粉培養的單倍體育種, 已經作為一種嶄新的育種手段問世, 並已開始育成大面積種植的作物新品種. 在單倍體育種方面, 我國科學家做出了突出貢獻. 1974 年就育成了世界上第一個作物新品種——單育1 號煙草品種. 隨後又育成了中花8號水稻和京花1號、京單92 - 2097 小麥等面積栽培的作物新品種, 還獲得了多種作物的大量花培新品系. 河南省在花培育種方面卓有成效, 培育出了花培28、花配2321、峽麥1號、豫麥37號、花9、花特早、豫麥60 號等優良品種( 系) , 已累計推廣700 多萬畝,在全國名列前茅.

( 2) 胚胎培養  在植物種間雜交或遠緣雜交中, 雜交不孕給遠緣雜交帶來了許多困難. 而採用胚的早期離體培養可以使胚正常發育並成功地培養出雜交後代, 可以通過無性系繁殖獲得數量較多、性狀一致的群體, 胚培養已在50多個科屬中獲得成功. 遠緣雜交中, 可把未XX的胚珠分離出來, 在試管內用異種花

粉在胚珠上萌發XX, 產生的雜種胚在試管中發育成完整植株, 此法稱為「試管XX」.用胚乳培養可以獲得三倍體植株, 為誘導形成三倍體植物開闢了一條新途徑. 三倍體加倍后可得到六倍體, 可育成多倍體新品種.

( 3) 細胞融合  通過原生質體融合, 可部分克服有性雜交不親和性, 而獲得體細胞雜種, 從而創造新種或育成優良品種, 這是組織培養應用最誘人的一個方面. 目前已獲得40 余個種間、屬間、甚至科間的體細胞雜種、愈傷組織, 有些還進而分化成苗. 目前, 採用原生質體融合技術已經能從不雜交的植物中如番茄和馬鈴薯、煙草和龍葵芥菜油菜等獲得屬間雜種, 但這些雜種尚無實際應用價值. 隨著原生質體融合、選擇、培養技術的不斷成熟和發展, 今後可望獲得更多有一定應用價值的經濟作物體細胞雜種及新品種.

( 4) 基因工程  用基因工程的方法, 把目標基因切割下來並通過載體使外來基因整合進植物的基因組是完全有可能的, 這項研究如果獲得成功, 將克服作物育種中的盲目性, 而變成按人們的需要操縱作物的遺傳變異, 育成優良品種. 目前這項研究剛剛起步, 加上植物的遺傳背景比原核生物更為複雜, 因此, 要

用基因工程實現作物改良, 以增加產量和改善品質, 將是21 世紀需要解決一個問題.

( 5) 培養細胞突變體  無論是愈傷組織培養還是細胞培養, 培養細胞均處在不斷分生狀態, 容易受培養條件和外界壓力( 如XX線、化學物質等) 的影響而產生誘變, 從中可以篩選出對人們有用的突變體, 從而育成新品種. 尤其對原來誘發突變較為困難、突變率較低的一些性狀, 用細胞培養進行誘發、篩選和鑒定

時, 處理細胞數遠遠多於處理個體數, 因此一些突變率極低的性狀有可能從中選擇出來. 例如植物抗病蟲性、抗寒、耐鹽、抗除草劑毒性、生理生化變異株等的誘發, 為進一步篩選和選育提供了豐富的變異材料. 目前, 用這種方法已篩選到抗病、抗鹽、高賴氨酸、高蛋白、矮稈高產的突變體, 有些已用於生產.

2. 2 在植物脫毒和快速繁殖上的應用

植物脫毒和離體快速繁殖是目前植物組織培養應用最多、最有效的一個方面. 很多農用物都帶有病毒, 特別是無性繁殖植物, 如馬鈴薯、甘薯、草莓、大蒜等. 但是, 感病植株並非每個部位都帶有病毒, White早在1943 年就發現植物生長點附近的病毒濃度很低甚至無病毒. 如果利用組織培養方法, 取一定大小的莖尖進行培養, 再生的植株有可能不帶病毒, 從而獲得脫病毒苗, 再用脫毒苗進行繁殖, 則種植的作物就不會或極少發生病毒. 目前組織培養在甘蔗、菠蘿、香蕉、草莓等主要經濟作物上已成功應用. 取用的外植體已不僅限莖尖, 其他如側芽、鱗片、葉片、球莖、根等都可以應用.由於組織培養法繁殖作物的突出特點是快速, 因此, 對一些繁殖係數低、不能用種子繁殖的「名、優、特、新、奇」作物品種的繁殖, 意義更大. 對於脫毒苗、新育成、新引進、稀缺育種、優良單株、瀕危植物和基因工程植株等可通過離體快速繁殖, 同時可不受地區、氣候的影響, 比常規方法快數萬倍到數百萬倍的速度擴大繁殖, 及時提供大量優質種薯和種苗. 馬鈴薯莖類脫毒、無毒種苗和微型脫毒種薯已在馬鈴薯生產上廣泛應用, 從根本上解決了馬鈴薯的退化問題. 目前, 觀賞植物、園藝作物、經濟林木、無性繁殖作物等部分或大部分都用離體快繁提供苗木, 試管苗已出現在國際市場上並形成產業化.

2. 3 在植物有用產物生產上的應用

利用組織或細胞的大規模培養, 有可能生產出人類所需要的一切天然有機化合物, 如蛋白質、脂肪糖類藥物香料、生物緘及其他活性化合物. 因此, 近年來這一領域已引起人們的極大興趣, 許多產業部門紛紛投資進行研究. 目前, 大約已有20 多種植物的培養組織中有效物質高於原植物, 國際上已獲得這方面專利100 多項. 近年來, 用單細胞培養生產蛋白質, 將給飼料食品工業提供廣闊的原料生產前途; 用組織培養方法生產微生物以及人工不能合成的藥物或有效成分的研究, 正在不斷深入, 有些已投入工業化生產,預計今後將有更大發展.

2. 4 在植物種質資源保存和交換上的應用

農業生產是在現有種質資源的基礎上進行的, 由於自然災害和生物之間的競爭以及人類活動對大自然的影響, 已有相當數量的植物物種在地球上消失或正在消失. 具有獨特遺傳性狀的生物物種的絕跡是一種不可挽回的損失. 利用植物組織和細胞法低溫保存種質, 可大大節約人力、物力和土地, 同時也便於種質

資源的交換和轉移, 防止有害病蟲的人為傳播, 給保存和搶救有用基因帶來了希望. 例如胡蘿蔔和煙草等植物的細胞懸浮物, 在- 20℃至-196℃ 的低溫下貯藏數月, 尚能恢復生長, 再生成植株.

2. 5 在遺傳、生理、生化和病理研究上的應用

組織培養推動了植物遺傳、生理、生化和病理學的研究, 已成為植物科學研究中的常規方法. 花藥和花粉培養獲得的單倍體和純合二倍體植株, 是研究細胞遺傳的極好材料. 在細胞培養中很容易引起變異和染色體變化, 從而可得到作物的附加系、代換系和易位系等新類型, 為研究染色工程開闢了新途徑.細胞培養和組織培養為研究植物生理活動提供了一種極有力的手段. 植物組織培養工作曾在礦質營養、有機營養、生長活性物質等方面開展了很多研究, 有益於了解植物的營養問題. 用單細胞培養研究植物的光合代謝是非常理想的, 近年來, 光自養培養研究也是十分有效的. 在細胞的生物合成研究中, 細胞組織培養也極為有用, 如查明了尼古丁在煙草中的部位等. 細胞培養為研究病理學提供了方便, 如植物的抗病性就可以單細胞或原生質體培養進行鑒定, 幾天之內就可以得到結果.

參考資料 1. 園林網 .園林供求網 .2012-10-20 [引用日期2012-10-20] .

相關文獻廣西林科院生物組織培養實驗樓擴建工程規劃設計-現代農業科技-2011年 第6期

狹葉杜香組織培養方法-特種經濟動植物-2011年 第4期

園林植物組織培養過程中褐化問題的研究-科技創新導報-2011年 第10期

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1植物組培發展簡史2植物組培的應用前景3分類4步驟4.1培養基配製4.2滅菌4.3接種4.4培養4.5馴化移栽5組織培養的優點6組織培養的應用7植物組織培養應用7.1基本概念7.2 應用現狀

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1植物組培發展簡史植物組織培養與細胞培養開始於19世紀後半葉,當時植物細胞全能性的概念還沒有完全確定,但基於對自然狀態下某些植物可以通過無性繁殖產生後代的觀察,人們便產生了這樣一種想法即能否將植物體的一部分在適當的條件下培養成一個完整的植物體,為此許多植物科學工作者開始了培養植物組織的嘗試。最初的問題仍然是集中在植物細胞有沒有全能性和如何使這種全能性表現出來。

1839年Schwann提出細胞有機體的每一個生活細胞在適宜的外部環境條件下都有獨立發育的潛能。1853年trecul利用離體的莖段和根段進行培養獲得了愈傷組織,愈傷組織是指一種沒有器官分化但能進行活躍分裂的細胞團,但這還不能證明細胞具有全能性,因為由愈傷組織沒能再生出完整植物體。1901年Morgan首次提出一個全能性細胞應具有發育出一個完整植株的能力。所謂全能性細胞就是指具有完整的膜系統和細胞核的生活細胞,在適宜的條件下可通過細胞分裂與分化,再生出一個完整植株。White指出:如果一個給定的有機體的所有細胞都大致相同,並具有全能性,那麼在有機體內所觀察到的細胞分化必定是這些細胞對有機體內微環境和周圍環境的反應。就是說機體內每個細胞所以沒有表現出全能性,是因為該細胞所處位置的不同,致使其某些功能被抑制(suppressed),這充分說明機體內的微環境因素在細胞分化中起了十分重要的作用。按照現代發育生物學和細胞生物學的理論,細胞分化是受基因在時間和空間兩個方面的調控,空間就是指細胞在機體內所處的位置。不同位置的細胞,其基因的表達不同,細胞所表現出的形態結構和行為就不同。如果將一個生活的細胞從植物體內分離出來,使之脫離開原有的環境,細胞被抑制的功能將有望得以恢復,重新表現出全能性。基於這種認識,科學工作者便萌生出了植物組織培養的念頭。

Haberlandt(1902)首次提出細胞培養的概念,也是第一個用人工培養基對分離的植物細胞進行培養的人。與rechinger不同,Haberlandt相信切塊大小不會影響細胞增殖,但由於Haberlandt使用的培養液成分簡單,培養的細胞是高度分化的細胞,又沒採取消毒技術,所以實驗失敗,培養的細胞雖然存活了幾個月但沒能分裂。Haberlandt轉而對損傷修複發生興趣,提出激素作用的概念(leptohormone),與維管組織特別是韌皮部有關;另一類是創傷激素(woundhomone),與細胞損傷有關,為後來激素理論的建立和在組織培養中的廣泛應用奠定了基礎。但自Haberlandt的實驗之後直到1934年White培養番茄離體根尖的成功,其間的30多年裡,植物組織培養技術幾乎沒有什麼進展。分析其原因,主要就是培養基的成分和實驗所選取的材料不夠合適。

1934年White用離體的番茄根建立了第一個活躍生長的無性系,使根的離體培養實驗首次獲得了真正的成功,並首次發現和提出B族維生素B1、維生素B6和煙酸的重要性。與此同時,Cautheret在山毛柳和黑楊形成層組織的培養中也發現了B族維生素的作用,並使培養獲得了成功。Nobecourt也用胡蘿蔔建立了類似的連續生長的組織培養物。因此,Haberlandt、White和Nobecourt一起被譽為植物組織培養的奠基人。人們現在所用的若干培養方法和培養基,原則上都是他們在1939年所建立的方法和培養基演變的結果,幾乎所有的培養基中都添加了不同種類和不同數量的B族維生素。從此植物組織培養XX快速發展時期。1941年,Overbeek、Conklin和Blakeslee等用附加椰乳到培養基中,獲得了Datura離體胚培養的成功。椰乳成分複雜,含有多種不同的有機物,後來的研究發現,其中在組織培養中起主要作用的是腺嘌呤類激素或類似物。1944年,Skoog報道DNA的降解產物腺嘌呤和腺苷可以促進愈傷組織的生長,解除生長素對芽形成的抑製作用,誘導芽的形成。1948年,Caplin和Steward用實驗證明椰乳與2,4-D配合,對培養的胡蘿蔔和馬鈴薯組織的增殖起到明顯的促進作用。在用煙草髓細胞誘導愈傷組織的實驗中,Skoog,Miller等分離確定了6-呋喃氨基嘌呤對細胞分裂有促進作用,並命名為「激動素」(Kinetin)。之後,與此相關的同系物6-苄氨基嘌呤被合成,它也刺激培養物的細胞分裂。於是,出現了「細胞分裂素」這一集合名詞,專門用來指能刺激培養物細胞分裂的一組6-某基團的氨基嘌呤化合物。爾後,玉米素、異戊烯基腺嘌呤和其他細胞分裂素等植物激素的相繼發現,更增加了細胞分裂素的種類。由於發現生長素和細胞分裂素相互配合能調節細胞的分裂與分化,控制器官的分化,生長素高時可誘導根的形成,細胞分裂素高時可促進芽的分化,使植物組織培養的工作迅速取得突破。1958年美國的Steward和德國的Reinert分別由培養的胡蘿蔔細胞誘導形成了胚狀體,1965年由Vasil和Hildebrandt用單個分離的細胞培養獲得整個植株的再生,從而使植物細胞全能性的理論真正得到了科學的證實。從此之後,一批又一批植物的組織或器官通過培養的方法獲得了再生植株。

20世紀60年代,在植物組織培養方面的另外兩項成就就是劃分小孢子培養和原生質體培養的成功。Guha和Maheshwari(1966,1967),Rourgin和Nitsch(1967)先後利用煙草和胡蘿蔔的小孢子培養獲得單倍體植株,並成功地實現了染色體的加倍,使這種同源二倍體植株在5個月內收穫到種子。Cocking等用純化的纖維素酶和果膠酶處理煙草細胞,獲得原生質體,通過調節滲透壓的方法控制原生質體膨脹,使培養獲得成功,得到了再生植株。自20世紀60年代始,植物組織與細胞培養逐漸走向了工廠化和商品化階段。

現在已不能確切統計有多少種植物通過組織培養的方法獲得了再生植株,因為幾乎每天都有可能出現利用新的植物種類獲得培養成功的報道。


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