原位雜交技術

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1原位雜交的基本原理編輯原位雜交技術的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的鹼基序列,將有放XX性或非放XX性的外源核酸(即探針)與組織細胞染色體上待測DNA或RNA互補配對,結合成專一的核酸雜交分子,經一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。為顯示特定的核酸序列必須具備3個重要條件:組織、細胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補的核苷酸序列(即探針)、有與探針結合的標記物(曾呈奎等2000)。

RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學或RNA原位雜交。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是:在細胞或組織結構保持不變的條件下,用標記的已知的RNA核苷酸片段,按核酸雜交中鹼基配對原則,與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合(雜交),所形成的雜交體 (Hybrids)經顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術 經不斷改進,其應用的領域已遠超出DNA原位雜交技術。尤其在基因分析診斷方面能作定性、定位和定量分析,已 成為最有效的分子病理學技術,同時在分析低丰度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物的一重要方向。

2原位雜交技術分類編輯基因組原位雜交技術基因組原位雜交(Genome in situ hybridization,GISH)技術是20世紀80年代末發展起來的一種原位雜交技術。它主要是利用物種之間DNA同源性的差異,用另一物種的基因組DNA以適當的濃度作封阻,在靶染色體上進行原位雜交。GISH技術最初應用於動物方面的研究(Pinkel et al.,1986),在植物上最早應用於小麥雜種和栽培種的鑒定(余舜武等 2001;王文奎等 2000)。

熒光原位雜交技術熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技術是在已有的放XX性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放XX性DNA分子原位雜交技術。它利用熒游標記的核酸片段為探針,與染色體上或DNA顯微切片上的特異fl-N:~行雜交,通過熒光檢測系統(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的目的DNA序列,進而確定其雜交位點。FISH技術檢測時間短,檢測靈敏度高,無污染,已廣泛應用於染色體的鑒定、基因定位和異常染色體檢測等領域。FISH是原位雜交技術大家族中的一員,因其所用探針被熒光物質標記(間接或直接)而得名,該方法在80年代末 被發明,現已從實驗逐步XX臨床診斷領域。 基本原理是熒游標記的核酸探針在變性后與已變性的靶核酸在退火 溫度下復性;通過熒光顯微鏡觀察熒光信號可在不改變被分析對象(即維持其原位)的前提下對靶核酸進行分析。 DNA熒游標記探針是其中最常用的一類核酸探針。利用此探針可對組織、細胞或染色體中的DNA進行染色體及基因水平 的分析。熒游標記控針不對環境構成污染,靈敏度能得到保障,可進行多色觀察分析,因而可同使用多個探針,縮 短因單個探針分開使用導致的周期過程和技術障礙。

多彩色熒光原位雜交技術多彩色熒光原位雜交(Multicolor fluorescence in situ hybridization,mFISH)是在熒光原位雜交技術的基礎上發展起來的一種新技術,它用幾種不同顏色的熒光素單獨或混合標記的探針進行原位雜交,能同時檢測多個靶位,各靶位在熒光顯微鏡下和照片上的顏色不同,呈現多種色彩,因而被稱為多彩色熒光原位雜交。它克服了FISH技術的局限,能同時檢測多個基因,在檢測遺傳物質的突變和染色體上基因定位等方面得到了廣泛的應用(楊明傑等1998)。

原位PCR原位PCR技術是常規的原位雜交技術與PCR技術的有機結合,即通過PCR技術對靶核酸序列在染色體上或組織細胞內進行原位擴增使其拷貝數增加,然後通過原位雜交技術進行檢測,從而對靶核酸序列進行定性、定位和定量分析。原位PCR技術大大提高了原位雜交技術的靈敏度和專一性,可用於低拷貝甚至單拷貝的基因定位,為原位雜交技術的發展提供了更廣闊的發展前景。

原位雜交技術因其高度的靈敏性和準確性而日益受到許多科研工作者的歡迎,並廣泛應用到基因定位、性別鑒定基因圖譜的構建等研究領域。目前原位雜交技術在植物中的應用比較廣泛,例如在棉花、麥類和樹木等的遺傳育種方面取得了顯著的成就,在畜牧上原位雜交技術主要用於基因定位和基因圖譜的構建以及轉基因的檢測和性別鑒定等方面。在水產方面,原位雜交技術則主要應用於基因定位(多見於對魚類和貝類等水生物的研究)和病毒的檢測(多見於蝦類)。此外,原位雜交技術做為染色體高分辨顯帶技術的補充和發展,在水生物的細胞遺傳學的研究領域將發揮更重要的作用。同其他的生物技術一樣,原位雜交技術在其發展與應用的過程中會出現一些問題,但隨著原位雜交技術的不斷改進與完善以及檢測手段的改進,原位雜交技術的優越性越來越突出,其應用也會更加廣泛。


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