反轉錄酶

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轉錄(Reversetranscripatase)是以RNA為模板指導三磷酸脫氧核苷酸合成互補DNA(cDNA)的酶。哺乳類C型病毒的反轉錄酶和鼠類B型病毒的反轉錄酶都是一條多肽鏈。鳥類RNA病毒的反轉錄酶則由兩上亞基結構。真核生物中也都分離出具有不同結構的反轉錄酶。

目 錄1簡介

2合成步驟

3主要特點

4質量控制

5使用說明

6注意事項

7醫學發展

8社會效益

1簡介這是一種莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反轉錄酶(簡稱M-MLVRTase), 反轉錄酶

這個酶已經作了遺傳性上的改變,即除去了與它聯在一起的核糖核酸酶H活性(一種專門切割DNA與RNA雜交鏈上RNA分子的酶)。這個酶應用於cDNA的第一鏈合成和引物的延伸。這種酶需要鎂離子或錳離子作為輔助因子,當以mRNA為模板時,先合成單鏈DNA(ssDNA),再在反轉錄酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下,以單鏈DNA為模板合成「髮夾」型的雙鏈DNA(dsDNA),再由核酸酶S1切成二條單鏈的雙鏈DNA。因此,反轉錄酶可用來把任何基因的mRNA反轉錄成cDNA拷貝,然後可大量擴增XX載體后的cDNA。也可用來標記cDNA作為放XX性的分子探針。

逆轉錄酶(M-MLV)從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來,可用於合成第一鏈cDNA、製作cDNA探針、RNA轉錄、測序和RNA的逆轉錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失,所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同,同時其延伸能力也有顯著提高。逆轉錄酶(M-MLV)一個活性單位定義為在37℃,10min條件下,使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉澱物質所需的酶量。

2合成步驟1、使用前每個組份輕輕混勻,然後2000rpm離心20s

2、取滅過菌且無核酸酶的0.2ml離心管,依次加入2~5μgRNAnμL

3、65℃保溫5min,然後冰浴5min;

4、往3步驟中的0.2ml離心管依次加入下列組份

RNase抑製劑(40u/μL)0.5μL

10×M-MLVReactionBuffer2μL

DTT(200mM)1μL

逆轉錄酶(M-MLV)1μL

5、輕輕混勻后,然後2000rpm離心20s;

6、先在37℃保溫1hr,然後70℃保溫15min;

7、上述產物可立即進行下一步的PCR反應或-20℃保存

3主要特點多反轉錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性[1]。

①DNA聚合酶活性;以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高[1]。

②RNase H活性;由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNase H從RNA5′端水解掉RNA分子[1]。

③DNA指導的DNA聚合酶活性;以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子[1]。

除此之外,有些反轉錄酶還有DNA內切酶活性,這可能與病毒基因整合宿主細胞染色體DNA中有關。反轉錄酶的發現對於遺傳工程技術起了很大的推動作用,目它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA並以它為模板,在反轉錄酶的作用下,合成出互補的DNA(cDNA),由此可構建出cDNA文庫(cDNa library),從中篩選特異的目的基因,這是在基因工程技術中最常用的獲得目的基因的方法,詳見基因工程一章[1]。

4質量控制1.切口酶:在與200單位酶37oC保溫60分鐘后,超螺旋質粒保留在90%以上。

2.DNase測定:200單位酶與50ng3H-DNA37oC保溫60分鐘,分解出的放XX性低 反轉錄酶

于1%。

3.RNase測定:200單位酶與50ng3H-RNA37oC保溫60分鐘,分解出的放XX性低

于3%。

4.第一鏈cDNA的反應:在標準化的反應中,200單位酶催化從1mg1.2kbRNA或

1mg7.5kbRNA將同位素摻入到cDNA中,通過放XX自顯影,對於1.2kb的RNA,產物

cDNA是單一的、全長的條帶。對於7.5kb的RNA產物有部分是全長的條帶。用這二種

RNA放XX性轉換到cDNA中有12%。

5.RNaseH活性:200單位酶與polyA:polydT37oC保溫60分鐘,釋放出的放XX

性要低於1%。

6.物理純度:在SDS-PAGE上>90%純。

儲存緩衝液:20mMTris-HClpH7.5;200mMNaCl;0.1mMEDTA;1mMDTT;0.01%NP-40(一種

去垢劑)和50%甘油。

反應緩衝液:250mMTris-HClpH8.3;375mMKCl;15mMMgCl2;50mMDTT(以Part#M531A供應)。

5使用說明M-MLV反轉錄酶比AMV反轉錄酶缺乏連續性,因此要獲得像AMV反轉錄酶反應中產生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉錄酶。用1微克的mRNA起始合成第一條鏈的cDNA,要用8單位的M-MLV反轉錄酶才相當於1單位的AMV反轉錄酶的作用。 反轉錄酶

該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制,該酶絕對不能用Promega的RiboprobeAMV反轉錄酶5X反應緩衝液,也不能用Promega的RiboclonecDNA第一條鏈緩衝液,因為這二種緩衝液均含有亞精胺。

6注意事項反轉錄酶

在進行RT反應之前,應考慮以下幾個方面:

1、RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA,高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑製劑,如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中,要特別防止RNase的污染,同時在逆轉錄反應中經常加入RNase抑製劑以增加cDNA合成的長度產量。RNase抑製劑要在第一鏈cDNA合成反應中,在緩衝液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑製劑變性,從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑製劑僅防止RNaseA,B,C對RNA的降解,並不能防止皮膚上的RNase,因此儘管使用了這些抑製劑,也要小心不要從手指上引入RNase,實驗過程中經常更換新手套。

2、引物的選擇

OligodT

選擇OligodT時,要求RNA必須有PolyA,所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT,所以對RNA樣品的質量要求較高,最好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應,建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。

隨機引物

適合各種RNA的RT,尤其適合模板丰度很低的情況(比如某個gene表達量很低)。選擇隨機引物時,第一鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板,然後進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關係,一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng,如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng,可能會導致小片段產物(> 查看更多相關文獻

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自然科學遺傳學生物生物化學內科學應用科學科學 病毒 , 酶 , 生物學

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1簡介這是一種莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukeminvirus)反轉錄酶(簡稱M-MLVRTase), 反轉錄酶

這個酶已經作了遺傳性上的改變,即除去了與它聯在一起的核糖核酸酶H活性(一種專門切割DNA與RNA雜交鏈上RNA分子的酶)。這個酶應用於cDNA的第一鏈合成和引物的延伸。這種酶需要鎂離子或錳離子作為輔助因子,當以mRNA為模板時,先合成單鏈DNA(ssDNA),再在反轉錄酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下,以單鏈DNA為模板合成「髮夾」型的雙鏈DNA(dsDNA),再由核酸酶S1切成二條單鏈的雙鏈DNA。因此,反轉錄酶可用來把任何基因的mRNA反轉錄成cDNA拷貝,然後可大量擴增XX載體后的cDNA。也可用來標記cDNA作為放XX性的分子探針。

逆轉錄酶(M-MLV)從MoloneyMurineLeukemiaVirus分離出來,可用於合成第一鏈cDNA、製作cDNA探針、RNA轉錄、測序和RNA的逆轉錄反應。本酶是通過點突變使RNaseH活性缺失,所以它具有的DNA聚合酶的活性與野生型相同,同時其延伸能力也有顯著提高。逆轉錄酶(M-MLV)一個活性單位定義為在37℃,10min條件下,使1nmol的脫氧核糖核酸摻入酸性沉澱物質所需的酶量。

2合成步驟1、使用前每個組份輕輕混勻,然後2000rpm離心20s

2、取滅過菌且無核酸酶的0.2ml離心管,依次加入2~5μgRNAnμL

3、65℃保溫5min,然後冰浴5min;

4、往3步驟中的0.2ml離心管依次加入下列組份

RNase抑製劑(40u/μL)0.5μL

10×M-MLVReactionBuffer2μL

DTT(200mM)1μL

逆轉錄酶(M-MLV)1μL

5、輕輕混勻后,然後2000rpm離心20s;

6、先在37℃保溫1hr,然後70℃保溫15min;

7、上述產物可立即進行下一步的PCR反應或-20℃保存。

3主要特點多反轉錄酶都具有多種酶活性,主要包括以下幾種活性[1]。

①DNA聚合酶活性;以RNA為模板,催化dNTP聚合成DNA的過程。此酶需要RNA為引物,多為色氨酸的tRNA,在引物tRNA3′-末端以5′→3′方向合成DNA。反轉錄酶中不具有3′→5′外切酶活性,因此沒有校正功能,所以由反轉錄酶催化合成的DNA出錯率比較高[1]。

②RNase H活性;由反轉錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子,將由RNase H從RNA5′端水解掉RNA分子[1]。

③DNA指導的DNA聚合酶活性;以反轉錄合成的第一條DNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成第二條DNA分子[1]。

除此之外,有些反轉錄酶還有DNA內切酶活性,這可能與病毒基因整合到宿主細胞染色體DNA中有關。反轉錄酶的發現對於遺傳工程技術起了很大的推動作用,目它已成為一種重要的工具酶。用組織細胞提取mRNA並以它為模板,在反轉錄酶的作用下,合成出互補的DNA(cDNA),由此可構建出cDNA文庫(cDNa library),從中篩選特異的目的基因,這是在基因工程技術中最常用的獲得目的基因的方法,詳見基因工程一章[1]。

4質量控制1.切口酶:在與200單位酶37oC保溫60分鐘后,超螺旋質粒保留在90%以上。

2.DNase測定:200單位酶與50ng3H-DNA37oC保溫60分鐘,分解出的放XX性低 反轉錄酶

于1%。

3.RNase測定:200單位酶與50ng3H-RNA37oC保溫60分鐘,分解出的放XX性低

于3%。

4.第一鏈cDNA的反應:在標準化的反應中,200單位酶催化從1mg1.2kbRNA或

1mg7.5kbRNA將同位素摻入到cDNA中,通過放XX自顯影,對於1.2kb的RNA,產物

cDNA是單一的、全長的條帶。對於7.5kb的RNA產物有部分是全長的條帶。用這二種

RNA放XX性轉換到cDNA中有12%。

5.RNaseH活性:200單位酶與polyA:polydT37oC保溫60分鐘,釋放出的放XX

性要低於1%。

6.物理純度:在SDS-PAGE上>90%純。

儲存緩衝液:20mMTris-HClpH7.5;200mMNaCl;0.1mMEDTA;1mMDTT;0.01%NP-40(一種

去垢劑)和50%甘油。

反應緩衝液:250mMTris-HClpH8.3;375mMKCl;15mMMgCl2;50mMDTT(以Part#M531A供應)。

5使用說明M-MLV反轉錄酶比AMV反轉錄酶缺乏連續性,因此要獲得像AMV反轉錄酶反應中產生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉錄酶。用1微克的mRNA起始合成第一條鏈的cDNA,要用8單位的M-MLV反轉錄酶才相當於1單位的AMV反轉錄酶的作用。 反轉錄酶

該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制,該酶絕對不能用Promega的RiboprobeAMV反轉錄酶5X反應緩衝液,也不能用Promega的RiboclonecDNA第一條鏈緩衝液,因為這二種緩衝液均含有亞精胺。

6注意事項反轉錄酶

在進行RT反應之前,應考慮以下幾個方面:

1、RNA

成功的cDNA合成來自高質量的RNA,高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑製劑,如EDTA或SDS。在提取RNA的過程中,要特別防止RNase的污染,同時在逆轉錄反應中經常加入RNase抑製劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑製劑要在第一鏈cDNA合成反應中,在緩衝液和還原劑(如DTT)存在的條件下加入,因為cDNA合成前的過程會使抑製劑變性,從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑製劑僅防止RNaseA,B,C對RNA的降解,並不能防止皮膚上的RNase,因此儘管使用了這些抑製劑,也要小心不要從手指上引入RNase,實驗過程中經常更換新手套。

2、引物的選擇

OligodT

選擇OligodT時,要求RNA必須有PolyA,所以真核生物的mRNA都適用。適合長鏈甚至全長mRNA的RT,所以對RNA樣品的質量要求較高,最好不要有明顯的DNA污染、RNA降解和RNA斷裂。假如想探索新的mRNA進行RT反應,建議推薦使用OligodT引物。使用OligodT引物要比隨機引物和特異性引物的穩定性要好。

隨機引物

適合各種RNA的RT,尤其適合模板丰度很低的情況(比如某個gene表達量很低)。選擇隨機引物時,第一鏈cDNA合成反應中就是以所有的RNA為模板,然後進行PCR反應時設計引物進行特異性擴增。同時要注意隨機引物的量和總RNA量之間的關係,一般建議每5μg總RNA的隨機引物的用量為50ng,如果每5μg總RNA的隨機引物的用量超過250ng,可能會導致小片段產物(