高效液相色譜法

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高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography HPLC又稱高壓液相色譜高速液相色譜高分離度液相色譜近代柱色譜等高效液相色譜是色譜法的一個重要分支以液體流動相採用高壓輸液系統將具有不同極性的單一溶劑或不同比例混合溶劑緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱在柱內各成分被分離後XX檢測器進行檢測從而實現對試樣的分析該方法已成為化學醫學工業農學商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術

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目 錄1歷史

2特點

3基本概念和術語

4主要類型

5結構

5.1 綜述

5.2 技術動態

5.3 高壓輸液泵

5.4 色譜柱

5.5 進樣器

5.6 餾分收集器

5.7 數據獲取和處理系統

6分離原理

6.1 液-液分配色譜法

6.2 液—固色譜法

6.3 離子交換色譜法

6.4 離子對色譜法

6.5 離子色譜法

6.6 空間排阻色譜法

7流程

8使用

8.1 綜述

8.2 拖尾因子

9測定

10選型

10.1 綜述

10.2 相對分子質量

10.3 溶解

10.4 化學結構

11設備

11.1 綜述

11.2 高壓泵

11.3 梯度洗提

11.4 進樣裝置

11.5 色譜柱

11.6 檢測器

12正反色譜

13實例

14液相色譜理論發展簡況

15相色譜法

1歷史1906年俄國植物化學家茨維特Tswett首次提出色譜法Chromotography和 實驗室最常用的P230高效液相色譜儀

色譜圖Chromatogram的概念他在論文中寫到

原文一植物色素石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入沿管濾下後用純石油醚淋洗結果按照不同色素的吸附順序在管內觀察到它們相應的色帶就象光譜一樣稱之為色譜圖

1930年以後相繼出現了紙色譜離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術

1952年英國學者Martin和Synge 基於他們在分配色譜方面的研究工作提出了關於氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法把色譜技術向前推進了一大步這是氣相色譜在此後的十多年間發展十分迅速的原因

1958年基於Moore和Stein的工作離子交換色譜的儀器化導致了氨基酸分析儀的出現這是近代液相色譜的一個重要嘗試但分離效率尚不理想

1960年中後期氣相色譜理論和實踐發展以及機械光學電子等技術上的進步液相色譜又開始活躍到60年代末期把高壓泵和化學鍵合固定相用於液相色譜就出現了HPLC

1970年中期以後微處理機技術用於液相色譜進一步提高了儀器的自動化水平和分析精度

1990年以後生物工程和生命科學在國際和國內的迅速發展為高效液相色譜技術提出了更多更新的分離純化製備的課題人類基因組計劃蛋白質組學有HPLC作預分離等

2特點高效液相色譜法有四高一廣的特點 高效液相色譜HPLC流程示意

①高壓流動相為液體流經色譜柱時受到的阻力較大為了能迅速通過色譜柱必須對載液加高壓

②高速分析速度快載液流速快較經典液體色譜法速度快得多通常分析一個樣品在15~30分鐘有些樣品甚至在5分鐘內即可完成一般小於1小時

③高效分離效能高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍

④高靈敏度紫外檢測器可達0.01ng進樣量在μL數量

⑤應用範圍廣百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析特別是高沸點大分子強極性熱穩定性差化合物的分離分析顯示出優勢

此外高效液相色譜還有色譜柱可反覆使用樣品不被破壞易回收等優點但也有缺點與氣相色譜相比各有所長相互補充高效液相色譜的缺點是有柱外效應在從進樣到檢測器之間除了柱子以外的任何死空間進樣器柱接頭連接管和檢測池等中如果流動相的流型有變化被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬柱效率降低高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜

3基本概念和術語色譜圖(chromatogram)樣品流經色譜柱和檢測器所得到的信號-時間曲線又稱色譜流出曲線(elution profile)

基線(base line)經流動相衝洗柱與流動相達到平衡后檢測器測出一段時間的流出曲線一般應平行於時間軸

噪音(noise)基線信號的波動通常因電源接觸不良或瞬時過載檢測器不穩定流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致

漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化主要由於操作條件如電壓溫度流動相及流量的不穩定所引起柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移

色譜峰(peak)組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線流出曲線上的突起部分正常色譜峰近似於對稱形正態分佈曲線高斯Gauss曲線不對稱色譜峰有兩種

前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)前者少見

峰底基線上峰的起點至終點的距離

峰高(peak heighth)峰的最高點至峰底的距離

峰寬peak widthW)峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離W=4σ

半峰寬peak width at half-heightWh/2)峰高一半處的峰寬Wh/2=2.355σ

面積(peak areaA)峰與峰底所包圍的面積

保留時間(retention timetR)從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間

理論塔板數(theoretical plate numberN)用於定量表示色譜柱的分離效率簡稱柱效

分離度(resolutionR)相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值也叫解析度表示相鄰兩峰的分離程度R≥1.5稱為完全分離

中國藥典規定R應大於1.5

拖尾因子(tailing factorT)T=用以衡量色譜峰的對稱性也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)

中國藥典規定T應為0.95~1.05

T1.05為拖尾峰[1]

4主要類型1吸附色譜(Absorption Chromatography)

2分配色譜(Partition Chromatography)

3離子色譜(Ion Chromatography)

4體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography)

5親和色譜(Affinity Chromatography)

5結構綜述高效液相色譜儀可分為高壓輸液泵色譜柱進樣器檢測器餾分收集器以及數據獲取與處理系統等部分

技術動態液相色譜和質譜連接可以增加額外的分析能力能夠準確鑒定和定量像細胞組織裂解液血液血漿尿液口腔液等複雜樣品基質中的微量化合物高效液相色譜質譜系統ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS提供了一些獨特的優勢包括

快速分析和流轉所需的最少樣品準備

高靈敏度並結合可分析多個化合物能力甚至可以跨越化合物的種類

高精確度高解析度鑒定和量化目標分析物

高壓輸液泵功能

驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統

性能要求

流量穩定±1)耐高壓(30~60Mpa)耐各種流動相例如有機溶劑水和緩衝液

種類

往複泵和隔膜泵

色譜柱功能

分離樣品中的各個物質

尺寸

10~30cm長2~5mm內徑的內壁拋光的不鏽鋼管柱

填料粒度

5 ~10μm 高效微粒固定相

進樣器功能

將待分析樣品引入色譜系統

種類

①注XX器10Mpa以下1~10μm微量注XX器進樣

②停流進樣

③閥進樣常用較理想體積可變可固定

④自動進樣器有利於重複操作實現自動化

檢測器 

功能

將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號

分類

①示差折光化學檢測器

②紫外吸收檢測器

③紫外-可見分光光度檢測器

二極體陣列紫外檢測器

熒光檢測器

電化學檢測器

餾分收集器功能

如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析而是為了做其它波譜鑒定或獲取少量試驗樣品的小型製備餾分收集是必要的

方法

①手工少數幾個餾分手續麻煩易出差

②餾分收集器收集比較理想微機控制操作準確

數據獲取和處理系統功能

把檢測器檢測到的信號顯示出來

6分離原理液-液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體流動相與固定相之間應互不相溶極性不同避免固定液流失有一個明顯的分界面當試樣XX色譜柱溶質在兩相間進行分配達到平衡時服從於高效液相色譜計算公式

高效液相色譜計算公式

式中cs溶質在固定相中濃度cm溶質在流動相中的濃度 Vs固定相的體積Vm流動相的體積LLPC與GPC有相似之處即分離的順序取決於KK大的組分保留值大但也有不同之處GPC中流動相對K影響不大LLPC流動相對K影響較大

a.正相液-液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性

b.反相液-液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性

c.液-液分配色譜法的缺點儘管流動相與固定相的極性要求完全不同但固定液在流動相中仍有微量溶解流動相通過色譜柱時的機械衝擊力會造成固定液流失上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相見后可克服上述缺點

液固色譜法流動相為液體固定相為吸附劑硅膠氧化鋁等這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的其作用機制是當試樣XX色譜柱時溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附未進樣時所有的吸附劑活性中心吸附的是S)可表示如下Xm nSa ====== Xa nSm

式中Xm--流動相中的溶質分子Sa--固定相中的溶劑分子Xa--固定相中的溶質分子Sm--流動相中的溶劑分子

當吸附競爭反應達平衡時

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中K為吸附平衡常數[討論K越大保留值越大]

離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以離子交換劑作為固定相IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流

動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離以陰離子交換劑為例其交換過程可表示如下

X-溶劑中 (樹脂-R4N Cl-)=== 樹脂-R4N X-) Cl- 溶劑中

當交換達平衡時

KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]

分配係數為

DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-]

[討論DX與保留值的關係]

凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離

離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)

離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物從而控制溶質離子的保留行為其原

離子色譜儀流程示意

理可用下式表示X水相Y-水相 === X Y-有機相

式中X 水相--流動相中待分離的有機離子也可是陽離子Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對如氫氧化四丁基銨氫氧化十六烷基三甲銨等X Y---形成的離子對化合物

當達平衡時

KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相

根據定義分配係數為

DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相

[討論DX與保留值的關係]

離子對色譜法特別是反相解決了以往難以分離的混合物的分離問題諸如酸鹼和離子非離子混合物特別是一些生化試樣如核酸核苷生物鹼以及藥物等分離

離子色譜法(Ion Chromatography)

用離子交換樹脂為固定相電解質溶液為流動相以電導檢測器為通用檢測器為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾設置了抑制柱試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同

陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相分離陰離子如Br-為例當待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)XX色譜柱時發生如下交換反應洗脫反應為交換反應的逆過程

擔體圖示

抑制柱上發生的反應

R-H Na OH- === R-Na H2O

R-H Na Br- === R-Na H Br-

可見通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水消除了本底電導的影響試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-可用電導法靈敏的檢測

離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法也可用於陽離子分析

空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)

空間排阻色譜法以凝膠(gel) 為固定相它類似於分子篩的作用但凝膠的孔徑比分子篩要大得多一般為數納米到數百納米溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離而是按分子大小進行分離分離只與凝膠的孔徑分佈和溶質的流動力學體積或分子大小有關試樣XX色譜柱后隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過在試樣中一些太大的分子不能XX膠孔而受到排阻因此就直接通過柱子首先在色譜圖上出現一些很小的分子可以XX所有膠孔並滲透到顆粒中這些組分在柱上的保留值最大在色譜圖上最後出現

7流程 流程

流程如右圖所示溶劑貯器⑴中的流動相被泵⑵吸入經3梯度控制器按一定的梯度進行混合然後輸出經⑷測其壓力和流量導入(5進樣閥器經⑹保護柱⑺分離柱後到⑻檢測器檢測由⑽數據處理設備處理數據或⑾記錄儀記錄色譜圖⑿餾分收集器收集餾分⒀為廢液

8使用綜述色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之氰基或氨基鍵合硅膠也有使用離子交換填料用於離子交換色譜凝膠或玻璃微球等用於分子排阻色譜等注樣量一般為數微升除另有規定外柱溫為室溫檢測器為紫外吸收檢測器

在用紫外吸收檢測器時所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求

正文中各品種項下規定的條件除固定相種類流動相組分檢測器類型不得任意改變外其餘如色譜柱內徑長度固定相牌號載體粒度流動相流速混合流動相各組分的比例柱溫進 化學鍵合固定相反應

樣量檢測器的靈敏度等均可適當改變

以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求一般色譜圖約于20分鐘內記錄完畢

系統適用性試驗

按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整應達到規定的要求或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數分離度和拖尾因子.

色譜柱的理論板數 在選定的條件下注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液記錄色譜圖 化學鍵合固定相應用

量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數應改變色譜柱的某些條件如柱長載體性能色譜柱充填的優劣等使理論板數達到要求

分離度 定量分析時為便於準確測量要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度分離度(R)的計算公式為R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時間 t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間 W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬除另外有規定外分離度應大於1.5

拖尾因子為保證測量精度特別當採用峰高法測量時應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求拖尾因子計算公式為

W(0.05h) T=-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬

d1為峰極大至峰前沿之間的距離除另有規定外,T應在0.95~1.05間

也可按各品種校正因子測定項下配製相當於80%100%和120%的對照品溶液加入規定量的內標溶液配成三種不同濃度的溶液分別注樣3次計算平均校正因子其相對標準偏差應不大於2.0%

9測定定量測定時可根據樣品的具體情況採用峰面積法或峰高法但用歸一法或內標法測定雜質總量時須採用峰面積法

面積歸一化法 測定供試品或經衍生化處理的供試品中各雜質及雜質的總量限度採用不加校正因子的峰面積歸一法計算各雜質峰面積及其總和並求出占總峰面積的百分率但溶劑峰不計算在內色譜 硅膠

圖的記錄時間應根據各品種所含雜質的保留時間決定除另有規定外可為該品種項下主成分保留時間的倍數

主成分自身對照法 

當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時採用主成分自身對照法在測定前先按各品種項下規定的雜質限度將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液進樣調節檢測器的靈敏度或進樣量使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準確測量要求然後取供試品溶液進樣記錄時間除另有規定外應為主成分保留時間的倍數根據測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和並和對照溶液主成分的峰面積比較計算雜質限度

內標法 測定供試品中雜質的總量限度

採用不加校正因子的峰面積法取供試品按各品種項下規定的方法配製不含內標物質的供試品溶液注入儀器記錄色譜圖Ⅰ再配製含有內標物質的供試品溶液在同樣的條件下注樣記錄色譜圖Ⅱ記錄的時間除另有規定外應為該品種項下規定的內標峰保留時間的倍數色譜圖上內標峰高應為記錄儀滿標度的30%以上否則應調整注樣量或檢測器靈敏度

如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內標峰保留時間相同的雜質峰則色譜圖Ⅱ中各雜質峰面積之和應小於內標物質峰面積溶劑峰不計在內如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內標物質峰保留時間相同的雜質峰應將色譜圖Ⅱ上的內標物質峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質峰面積即為內標物質峰的校正面積色譜圖Ⅱ中各雜質峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積即為各雜質峰的校正總面積各雜質峰的校正總面積應小於內標物質峰的校正面積

加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量

按各品種項下的規定精密稱量取對照品和內標物質分別配成溶液精密量取各溶液配成校正因子測定用的對照溶液取一定量注入儀器記錄色譜圖測量對照品和內標物質的峰面積或峰高按下式計算校正因子

As/ms]校正因子f=- Ar/mr 式中 As為內標物質的峰面積或峰高,Ar為對照品的峰面積或峰高 ms為加入內標物質的量mr為加入對照品的量再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液注入儀器記錄色譜圖測量供試品或其雜質峰和內標物質的峰面積或峰高按下式計算含量Ax 含量(mx)=f×-As/ms 式中 Ax為供試品或其雜質峰面積或峰高 mx為供試品或其雜質的量fAs和ms的意義同上

當配製校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一分內標物質溶液時則配製內標物質溶液不必精密稱量取

外標法 測定供試品中某個雜質或主成分含量

按各品種項下的規定精密稱量取對照品和供試品配製成溶液分別精密取一定量注入儀器記錄色譜圖測量對照品和供試品待測成分的峰面積或峰高按下式計算含量

A 含量(mx)=mr×-Ar式中各符號意義同上

由於微量注XX器不易精確控制進樣量當採用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時以定量環進樣為好

10選型綜述要正確地選擇色譜分離方法首先必須盡可能多的 了解樣品的有關性質其 選型常用參照表

次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用範圍選擇色譜分離方法的主要根據是樣品的相對分子質量的大小在水中和有機溶劑中的溶解度極性和穩定程度以及化學結構等物理化學性質

相對分子質量對於相對分子質量較低一般在200以下揮發性比較好加熱又不易分解的樣品可以選擇氣相色譜法進行分析相對分子質量在200 ~ 2000的化合物可用液固吸附液-液分配和離子交換色譜法相對分子質量高於2000則可用空間排阻色譜法

溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法微溶於水但在酸或鹼存在下能很好電離的化合物也可用離子交換色譜法油溶性樣品或相對非極性的混合物可用液-固色譜法

化學結構若樣品中包含離子型或可離子化的化合物或者能與離子型化合物相互作用的化合物例如配位體及有機螯合劑可首先考慮用離子交換色譜但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應用於離子化合物異構體的分離可用液固色譜法具有不同官能團的化合物同系物可用液液分配色譜法對於高分子聚合物可用空間排阻色譜法

11設備綜述HPLC的出現不過三十多年的時間但這種分離分析技術的發展十分迅猛應用十分廣泛其儀器結構和流程多種多樣典型的高效液相色譜儀結構和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-4)高效液相色譜儀一般都具備貯液器高壓泵梯度洗提裝置用雙泵進樣器色譜柱檢測器恆溫器記錄儀等主要部件

高效液相色譜更適宜於分離分析高沸點熱穩定性差有生理活性及相對分子量比較大的物質因而廣泛應用於核酸肽類內酯稠環芳烴高聚物藥物人體代謝產物表面活性劑抗氧化劑殺蟲劑除莠劑的分析等物質的分析

高壓泵 實例

HPLC使用的色譜柱是很細的(1~6 mm)所用固定相的粒度也非常小幾μm到幾十μm)所以流動相在柱中流動受到的阻力很大在常壓下流動相流速十分緩慢柱效低且費時為了達到快速高效分離必須給流動相施加很大的壓力以加快其在柱中的流動速度為此須用高壓泵進行高壓輸液高壓高速是高效液相色譜的特點之一 儀器主要組成

HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件

a. 流量恆定無脈動並有較大的調節範圍一般為1~10 mL/min)

b. 能抗溶劑腐蝕

c. 有較高的輸液壓力對一般分離60×10^5Pa的壓力就滿足了對高效分離要求達到150~300×10^5Pa

⑴往複式柱塞泵

當柱塞推入缸體時泵頭出口上部的單向閥打開同時流動相XX的單向閥下部關閉這時就輸出少量的流體反之當柱塞向外拉時流動相入口的單向閥打開出口的單向閥同時關閉一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響連續供給恆定體積的流動相

⑵氣動放大泵

其工作原理是壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積 SA 活塞A 則在小面積 SB 活塞 B 輸出壓力XX至 p2 的液體壓力XX的倍數取決於 A 和 B 兩活塞的面積比如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體這是一種恆壓泵

梯度洗提類似於GC中的程序升溫已成為現代高效液相色譜中不可缺少的部分 氣動放大泵

梯度洗提就是載液中含有兩種或更多不同極性的溶劑在分離過程中按一定的程序連續改變載液中溶劑的配比和極性通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素以提高分離效果梯度洗提可以分為兩種

a.低壓梯度也叫外梯度在常壓下預先按一定程序將兩種或多種不同極性的溶劑混合后再用一台高壓泵輸入色譜柱

b.高壓梯度 ( 或稱內梯度系統 ) 利用兩台高壓輸液泵將兩種不同極性的溶劑按設定的比例送入梯度混合室混合後XX色譜柱

進樣裝置⑴注XX器進樣裝置進樣所用微量注XX器及進樣方式與 GC法一樣進樣壓力150×10^5Pa時必須採用停流進樣⑵高壓定量進樣閥與GC法用的流通法相似能在高壓下進樣

色譜柱色譜柱是色譜儀最重要的部件心臟通常用厚壁玻璃管或內壁拋光的不鏽鋼管製作的對於一些有腐蝕性的樣品且要求耐高壓時可用銅管鋁管或聚四氟乙烯管柱子內徑一般為1~6 mm常用的標準柱型是內徑為4.6 或3.9mm 長度為15 ~30cm 的直形不鏽鋼柱填料顆粒度5 ~10μm 柱效以理論塔板數計大約 7000 ~10000

發展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效

檢測器⑴紫外光度檢測器

它的作用原理是基於被分析試樣組分對特定波長紫外光的選擇性吸收組分濃度與吸光度的關係遵守比爾定律最常用的檢測器應用最廣對大部分有機化合物有響應

特點

a.靈敏度高其最小檢測量10-9g·mL-1,故即使對紫外光吸收很弱的物質也可以檢測

b. 線性範圍寬比爾定律

c. 流通池可做的很小(1mm × 10mm 容積 8μL)

d. 對流動相的流速和溫度變化不敏感可用於梯度洗脫

e. 波長可選易於操作如使用裝有流通池的可見紫外分光光度計可變波長檢測器

缺點對紫外光完全不吸收的試樣不能檢測同時溶劑的選擇受到限制

⑵光電二極體陣列檢測器

紫外檢測器的重要進展陣列由1024個光電二極體陣列每個光電二極體寬僅50μm各檢測一窄段波長如圖所示在檢測器中光源發出的紫外或可見光通過液相色譜流通池在此流動相中的各個組分進行特徵吸收然後通過狹縫XX單色其進行分光最後由光電二極體陣列檢測得到各個組分的吸收信號經電腦快速處理得三維立體譜圖

⑶熒光檢測器

熒光檢測器是一種高靈敏度高選擇性檢測器

多環芳烴維生素B黃曲霉素卟啉類化合物農藥藥物氨基酸甾類化合物等有響應

熒光檢測器的結構及工作原理和熒光光度計相似

⑷差示折光檢測器

除紫外檢測器之外應用最多的檢測器

差示折光檢測器是借連續測定流通池中溶液折XX率的方法來測定試樣濃度的檢測器溶液的折XX率是純溶劑流動相和純溶質試樣折XX率乘以各物質的濃度之和因此溶有試樣的流動相和純流動相之間折XX率之差表示試樣在流動相中的濃度

⑸電導檢測器

其作用原理是根據物質在某些介質中電離后所產生電導變化來測定電離物質含量

12正反色譜正相色譜法

採用極性固定相如聚乙二醇氨基與腈基鍵合相流動相為相對非極性的疏水性溶劑烷烴類如正已烷環已烷常加入乙醇異丙醇四氫呋喃三氯甲烷等以調節組分的保留時間常用於分離中等極性和極性較強的化合物如酚類胺類羰基類及氨基酸類等

反相色譜法

一般用非極性固定相如C18C8)流動相為水或緩衝液常加入甲醇乙腈異丙醇丙酮四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間適用於分離非極性和極性較弱的化合物RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛據統計它占整個HPLC應用的80%左右

13實例高效液相色譜法只要求試樣能製成溶液而不需要氣化因此不受試樣揮發性的限制對於高沸點熱穩定性差相對分子量大大於400以上的有機物這些物質幾乎佔有機物總數的75%~80%原則上都可應用高效液相色譜法來進行分離分析據統計在已知化合物中能用氣相色譜分析的約占20%而能用液相色譜分析的約占70~80%

1環境中有機氯農藥殘留量分析

固定相薄殼型硅膠(37 ~50mm)

流動相正己烷

流速1.5 mL/min

色譜柱50cm´2.5mm內徑

檢測器差示折光檢測器

可對水果蔬菜中的農藥殘留量進行分析

2稠環芳烴的分析

稠環芳烴多為致癌物質

固定相十八烷基硅烷化鍵合相

流動相20%甲醇-水 ~100%甲醇線性梯度淋洗2%/min

流速1mL/min

柱 溫50℃

柱壓70 ´104 Pa

檢測器紫外檢測器

3陰離子分析

雙柱薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),

流動相0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1Na2CO3流量138 mL/hr

七種陰離子在20分鐘內基本上得到完全分離各組分含量在3~50 ppm

14液相色譜理論發展簡況液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相稱為經典液相色譜法此方法柱效低時間長常有幾個小時高效液相色譜法(High performance Liquid ChromatographyHPLC)是在經典液相色譜法的基礎上于60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的

它與經典液相色譜法的區別是填料顆粒小而均勻小顆粒具有高柱效但會引起高阻力需用高壓輸送流動相故又稱高壓液相色譜法(High Pressure Liquid ChromatographyHPLC)又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(High Speed Liquid ChromatographyHSLP)也稱現代液相色譜[2]

15相色譜法作者鄒漢法 張玉奎 盧佩章 定價¥ 42.00 元

出版社科學出版社 出版日期1998年11月

ISBN7-03-006716-9/O·1012 開本32 開

類別分析化學及儀器 頁數577 頁

簡介

本書比較系統全面地介紹液相色譜分離分析技術和方法的原理現狀及發展動態全書共分十四章內容包括緒論液相色譜理論基礎液相色譜固定相和流動相電腦在液相色譜分析中的應用樣品須處理液相色譜儀器液相色譜檢測技術和色譜峰定性定量液相色譜應用液相色譜手性化合物拆分和液相色譜的生物大分子分離純化和毛細管電色譜等

目錄

第一章緒論

1.1色譜法的定義和歷史

1.2色譜法的特點原理和應用範圍

1.3色譜法的分類

1.3.1體積排阻色譜

1.3.2離子交換色譜和離子色譜

1.3.3反相色譜

1.3.4離子對色譜

1.3.5疏水作用色譜

1.3.6親和色譜

1.4高效液相色譜與其它色譜方法的比羅

14.1現代高效液相色譜與經典液相色譜的比較

14.2高效液相色譜與氣相色譜的比較

第二章液相色譜過程動力學

2.1液相色譜動力學理論

2.1.1塔片理論

2.1.2隨機模型理論

2.1.3非平衡理論

2.1.4質量平衡理論

2.2影響色譜柱塔片高度的因素

2.3色譜峰形參數的規律性

2.3.1色譜峰半寬度的規律性

2.3.2色譜指數修正模型中參數的規律性

參考文獻

第三章液相色譜的熱力學過程

3.1中性化合物的物理化學模型

3.1.1頂替吸附模型

3.1.2溶質-溶劑相互作用模型

3.1.3溶解度理論

3.1.4頂替吸附-相互作用模型

3.1.5疏溶劑理論

3.1.6以分子作用力為基礎的液相色譜理論模型的比較

3.2基於離子靜電作用力的色譜保留機理

3.3液相色譜中各種參數保留值的影響

3.3.1有機溶劑濃度的影響

3.3.2無機鹽濃度的影響

3.3.3柱溫的影響

3.3.4固定相性質對保留值的影響

3.3.5流動相酸度對保留值的影響

3.3.6流動相中離子對試劑的影響

參考文獻

第四章高效液相色譜中溶質分子結構與保留值的定量關係

4.1色譜中的分子間相互作用

4.1.1離子偶極作用力

4.1.2定向作用力

4.1.3誘導作用力

4.1.4色散作用力

4.1.5疏水作用力

4.1.6氫鍵作用力

4.1.7電子對給體-電子對受體相互作用

4.2影響分子間作用力的因素

4.2.1偶極矩μ

4.2.2極化率α

4.2.3電離能(I)

4.2.4分子間的距離(r)

4.3分子結構參數

4.3.1與分子體積相關的結構參數

4.3.2反映溶質分子電子分佈的結構參數

4.3.3分子形狀的結構參數

4.3.4拓撲參數

4.4分子結構與保留值定量關係的應用

4.4.1高效液相色譜中的自由能關係

4.4.2分子結構色譜保留值定量關係用於色譜保留機旦的研究和保留值預測

4.4.3色譜保留值用於疏水性的測定

4.4.4液相色譜保留值與生物活性和一些環境化學參數的關係

參考文獻

第五章液相色譜固定和流動相

5.1液相色譜流動相

5.1.1正相色譜常用沖洗劑

5.1.2反相色譜常用沖洗劑

5.1.3反相離子對色譜法常用沖洗劑

5.2高效液相色譜常用固定相

5.2.1液-固吸附色譜固定相

5.2.2化學鍵合固定相

5.2.3鍵合固定相的分類

5.3其它基質材料的液相色譜固定相

5.3.1有機高分子基質的液相色譜固定相

5.3.2其它無機基質的液相色譜固定相

參考文獻

第六章液相色譜專家系統及其柱系統推薦

6.1專家系統的結構

6.1.1知識庫和知識表達

6.1.2推理機

6.2液相色譜專家系統及其應用

6.3色譜專家系統中的柱系統推薦規則庫

6.3.1分離模式選擇的基本條件

6.3.2液相色譜保留值和選擇性的一些基本規律

6.3.3液相色譜分離模式的推薦

6.3.4反相色譜流動相和固定相的選擇性原則

6.3.5液相色譜流動相和添加劑的推薦

6.3.6實際樣品對柱系統推薦規則的驗證

參考文獻

第七章液相色譜分離條件最優化

7.1段化參數與優化指標

7.1.1優化參數

7.1.2優化指標

7.2試驗設計方法

7.2.1正交設計

7.2.2因子設計

7.2.3混合設計

7.2.4勻殼設計

7.2.5均勻設計

7.3優化方法及其應用

7.3.1單純形優化方法

7.3.2複合形和重複設計優化方法

7.3.3窗口圖形法和重疊分辨分離度法

參考文獻

第八章樣品預處理技術

8.1液-液萃取

8.1.1萃取溶劑的選擇

8.1.2pH值的控制

8.1.3液-液萃取其它操作因素的控制

8.2液固萃取

8.2.1液-固萃取固定相和流動相

8.2.2固相萃取的影響因素

8.2.3固相萃取方法的建立

8.3膜技術在樣品預處理中的應用

8.3.1微滲析

8.3.2超濾膜技術

8.4衍生化和柱濃縮樣品預處理

8.4.1衍生化技術

8.4.2液相色譜柱濃縮預處理技術

參考文獻

第九章高效液相色儀器

9.1高壓輸液系統

9.1.1貯液系統

9.1.2高壓輸液泵

9.1.3梯度淋洗裝置

9.2進樣系統

9.2.1注XX器進樣

9.2.2閥進樣

9.2.3自動進樣器

9.3色譜柱系統

9.3.1色譜柱的結構

9.3.2色譜柱的填充

9.3.3色譜柱的評價

9.3.4色譜柱的使用技術

9.3.5色譜柱恆溫裝置與餾分收集器

參考文獻

第十章液相色譜檢測技術和色譜峰定性定量

10.1檢測器的性能指標

10.1.1雜訊和漂移

10.1.2靈敏度

10.1.3敏感度

10.1.4最小檢測量(Mmin)

10.1.5線性範圍

10.1.6譜峰的擴張

10.2液相色譜檢測器

10.2.1紫外吸收和紫外可見分光光度計

10.2.2示關折光檢測器

10.2.3熒光檢測器

10.2.4電導檢測器

10.2.52安培檢測器

10.3離子對色譜的抑制柱反應

10.4間接檢測方法

10.4.1間接檢測方法的基本原理

10.4.2間接檢測的理論基礎

10.4.3間接檢測系統的設計

10.4.4檢測靈敏度

10.5定性分析

10.5.1利用已知標準定性

10.5.2利用檢測器的選擇性定性

10.5.3利用紫外檢測器全波長掃描功能定性

10.5.4利用改變流動相組成時被測組分的保留值變化規律定性

10.5.5收集色譜柱流出各組分再用其它化學或物理方法定性

10.6定量分析

10.6.1峰面積的測量

10.6.2定量計算的幾種方法

參考文獻

第十一章高效液相色譜法的應用

11.1正相色譜的應用

11.2反相色譜的應用

11.2.1反相色譜在生物醫學上的應用

11.2.2反相色譜在食品分析中的應用

11.2.3反相色譜在環境分析中的應用

11.3反相離子對色譜的應用

11.3.1反相離子對色譜分離分析無機離子

11.3.2離子對色譜在生物橋學分析中的應用

參考文獻

第十二章手性對映體的HPLC拆分

12.1非對映異構化衍生拆分法

12.1.1異硫氰酸酯(ITC)及異氰酸酯(IC)

12.1.2萘衍生物(NAD)類

12.1.3酰氯與磺酰氯

12.1.4光學活性氨基酸類

12.1.5其它手性衍生試詢劑

12.2手性流動相拆分法

12.2.1配基交換型手法添加劑

12.2.2手性離子型絡合劑

12.2.3環型葡聚糖(CD)添加法

12.2.4其它手性流動相添加劑

12.3手性固定相拆分法

12.3.1蛋白質手性固定相

12.3.2聚合碳水化合物衍生物手性固定相

12.3.3空穴型手性固定相

12.3.4電子給予體電子受體型手性固定相(Pirkle型

12.3.5配基交換手性固定性

第十三章生物大分子的高效液相色譜分離分析

13.1生物大分子高效液相色譜的分離模式

13.1.1體積排阻色譜的分離機理

13.1.2離子交換色譜的分離機理

13.1.3疏水作用色譜的保留機理

13.1.4親和色譜的理論模型

13.1.5金屬絡合親和色譜

13.1.6共價色譜

13.2生物大分子分離分析用固定相

13.2.1有機高分子基質固定相

13.2.2無機基質生物大分子分離固定相

13.3生物大分子分離分析的影響因素

13.3.1尺寸排阻色譜的影響因素

13.3.2離子交換色譜的影響因素

13.3.3反相液相色譜的影響因素

13.3.4疏水作用色譜(HIC)的影響因素

13.3.5親和色譜的影響因素

13.4高效液相色譜在生物大分子分離分析中的應用

參考文獻

第十四章毛細管電色譜

14.1毛細管電色譜的基本原理

14.1.1毛細管電色譜中自加熱效應

14.1.2毛細管電色譜的譜帶展寬

14.1.3電色譜的保留機理

14.2毛細管電色譜儀器和柱製備

14.2.1毛細管電色譜填充柱的製備

14.2.2開管毛細管電色譜柱的製備

14.2.3毛細管電色譜的梯度洗脫技術

14.2.4毛細管電色譜與質譜聯用技術

14.3毛細管電色譜的應用

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參考資料 1. 高效液相色譜法基本概念和術語 .硅藻泥 [引用日期2013-10-30] .

2. 高效液相色譜法發展簡況 .硅藻泥裝修 [引用日期2013-10-30] .

相關文獻分散液液微萃取高效液相色譜法測定環境水樣中硝基苯-天津化工-2011年 第1期 (25)

對甲苯磺酸的高效液相色譜分析-當代化工-2011年 第1期 (40)

高效液相色譜在環境監測中的應用-環境研究與監測-2011年 第1期 (24)

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詞條標籤

自然科學分析化學色譜學設備設備與材料 高效液相色譜 , 醫藥對照品

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高效液相色譜

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參考資料

1歷史2特點3基本概念和術語4主要類型5結構5.1綜述5.2技術動態5.3高壓輸液泵5.4色譜柱5.5進樣器5.6餾分收集器5.7數據獲取和處理系統6分離原理6.1液-液分配色譜法6.2液—固色譜法6.3離子交換色譜法6.4離子對色譜法6.5離子色譜法6.6空間排阻色譜法7流程8使用8.1綜述8.2拖尾因子9測定10選型10.1綜述10.2相對分子質量10.3溶解度10.4化學結構11設備11.1綜述11.2高壓泵11.3梯度洗提11.4進樣裝置11.5色譜柱11.6檢測器12正反色譜13實例14液相色譜理論發展簡況15相色譜法

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1歷史1906年俄國植物化學家茨維特Tswett首次提出色譜法Chromotography和 實驗室最常用的P230高效液相色譜儀

色譜圖Chromatogram的概念他在論文中寫到

原文一植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入沿管濾下後用純石油醚淋洗結果按照不同色素的吸附順序在管內觀察到它們相應的色帶就象光譜一樣稱之為色譜圖

1930年以後相繼出現了紙色譜離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術

1952年英國學者Martin和Synge 基於他們在分配色譜方面的研究工作提出了關於氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法把色譜技術向前推進了一大步這是氣相色譜在此後的十多年間發展十分迅速的原因

1958年基於Moore和Stein的工作離子交換色譜的儀器化導致了氨基酸分析儀的出現這是近代液相色譜的一個重要嘗試但分離效率尚不理想

1960年中後期氣相色譜理論和實踐發展以及機械光學電子等技術上的進步液相色譜又開始活躍到60年代末期把高壓泵和化學鍵合固定相用於液相色譜就出現了HPLC

1970年中期以後微處理機技術用於液相色譜進一步提高了儀器的自動化水平和分析精度

1990年以後生物工程和生命科學在國際和國內的迅速發展為高效液相色譜技術提出了更多更新的分離純化製備的課題如人類基因組計劃蛋白質組學有HPLC作預分離等

2特點高效液相色譜法有四高一廣的特點 高效液相色譜HPLC流程示意

①高壓流動相為液體流經色譜柱時受到的阻力較大為了能迅速通過色譜柱必須對載液加高壓

②高速分析速度快載液流速快較經典液體色譜法速度快得多通常分析一個樣品在15~30分鐘有些樣品甚至在5分鐘內即可完成一般小於1小時

③高效分離效能高可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍

④高靈敏度紫外檢測器可達0.01ng進樣量在μL數量級

⑤應用範圍廣百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析特別是高沸點大分子強極性熱穩定性差化合物的分離分析顯示出優勢

此外高效液相色譜還有色譜柱可反覆使用樣品不被破壞易回收等優點但也有缺點與氣相色譜相比各有所長相互補充高效液相色譜的缺點是有柱外效應在從進樣到檢測器之間除了柱子以外的任何死空間進樣器柱接頭連接管和檢測池等中如果流動相的流型有變化被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬柱效率降低高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜

3基本概念和術語色譜圖(chromatogram)樣品流經色譜柱和檢測器所得到的信號-時間曲線又稱色譜流出曲線(elution profile)

基線(base line)經流動相衝洗柱與流動相達到平衡后檢測器測出一段時間的流出曲線一般應平行於時間軸

噪音(noise)基線信號的波動通常因電源接觸不良或瞬時過載檢測器不穩定流動相含有氣泡或色譜柱被污染所致

漂移(drift)基線隨時間的緩緩變化主要由於操作條件如電壓溫度流動相及流量的不穩定所引起柱內的污染物或固定相不斷被洗脫下來也會產生漂移

色譜峰(peak)組分流經檢測器時響應的連續信號產生的曲線流出曲線上的突起部分正常色譜峰近似於對稱形正態分佈曲線高斯Gauss曲線不對稱色譜峰有兩種

前延峰(leading peak)和拖尾峰(tailing peak)前者少見

峰底基線上峰的起點至終點的距離

峰高(peak heighth)峰的最高點至峰底的距離

峰寬peak widthW)峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離W=4σ

半峰寬peak width at half-heightWh/2)峰高一半處的峰寬Wh/2=2.355σ

峰面積(peak areaA)峰與峰底所包圍的面積

保留時間(retention timetR)從進樣開始到某個組分在柱后出現濃度極大值的時間

理論塔板數(theoretical plate numberN)用於定量表示色譜柱的分離效率簡稱柱效

分離度(resolutionR)相鄰兩峰的保留時間之差與平均峰寬的比值也叫解析度表示相鄰兩峰的分離程度R≥1.5稱為完全分離

中國藥典規定R應大於1.5

拖尾因子(tailing factorT)T=用以衡量色譜峰的對稱性也稱為對稱因子(symmetry factor)或不對稱因子(asymmetry factor)

中國藥典規定T應為0.95~1.05

T1.05為拖尾峰[1]

4主要類型1吸附色譜(Absorption Chromatography)

2分配色譜(Partition Chromatography)

3離子色譜(Ion Chromatography)

4體積排阻色譜(Size Exclusion Chromatography)

5親和色譜(Affinity Chromatography)

5結構綜述高效液相色譜儀可分為高壓輸液泵色譜柱進樣器檢測器餾分收集器以及數據獲取與處理系統等部分

技術動態液相色譜和質譜連接可以增加額外的分析能力能夠準確鑒定和定量像細胞和組織裂解液血液血漿尿液和口腔液等複雜樣品基質中的微量化合物高效液相色譜質譜系統ABSciex Eksigent LC / MS和LC / MS / MS提供了一些獨特的優勢包括

快速分析和流轉所需的最少樣品準備

高靈敏度並結合可分析多個化合物能力甚至可以跨越化合物的種類

高精確度高解析度鑒定和量化目標分析物

高壓輸液泵功能

驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統

性能要求

流量穩定±1)耐高壓(30~60Mpa)耐各種流動相例如有機溶劑水和緩衝液

種類

往複泵和隔膜泵

色譜柱功能

分離樣品中的各個物質

尺寸

10~30cm長2~5mm內徑的內壁拋光的不鏽鋼管柱

填料粒度

5 ~10μm 高效微粒固定相

進樣器功能

將待分析樣品引入色譜系統

種類

①注XX器10Mpa以下1~10μm微量注XX器進樣

②停流進樣

③閥進樣常用較理想體積可變可固定

④自動進樣器有利於重複操作實現自動化

檢測器 

功能

將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號

分類

①示差折光化學檢測器

②紫外吸收檢測器

③紫外-可見分光光度檢測器

④二極體陣列紫外檢測器

⑤熒光檢測器

⑥電化學檢測器

餾分收集器功能

如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析而是為了做其它波譜鑒定或獲取少量試驗樣品的小型製備餾分收集是必要的

方法

①手工少數幾個餾分手續麻煩易出差錯

②餾分收集器收集比較理想微機控制操作準確

數據獲取和處理系統功能

把檢測器檢測到的信號顯示出來

6分離原理液-液分配色譜法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體流動相與固定相之間應互不相溶極性不同避免固定液流失有一個明顯的分界面當試樣XX色譜柱溶質在兩相間進行分配達到平衡時服從於高效液相色譜計算公式

高效液相色譜計算公式

式中cs溶質在固定相中濃度cm溶質在流動相中的濃度 Vs固定相的體積Vm流動相的體積LLPC與GPC有相似之處即分離的順序取決於KK大的組分保留值大但也有不同之處GPC中流動相對K影響不大LLPC流動相對K影響較大

a.正相液-液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性

b.反相液-液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性

c.液-液分配色譜法的缺點儘管流動相與固定相的極性要求完全不同但固定液在流動相中仍有微量溶解流動相通過色譜柱時的機械衝擊力會造成固定液流失上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相見后可克服上述缺點

液固色譜法流動相為液體固定相為吸附劑如硅膠氧化鋁等這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的其作用機制是當試樣XX色譜柱時溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附未進樣時所有的吸附劑活性中心吸附的是S)可表示如下Xm nSa ====== Xa nSm

式中Xm--流動相中的溶質分子Sa--固定相中的溶劑分子Xa--固定相中的溶質分子Sm--流動相中的溶劑分子

當吸附競爭反應達平衡時

K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]

式中K為吸附平衡常數[討論K越大保留值越大]

離子交換色譜法(Ion-exchange Chromatography)

IEC是以離子交換劑作為固定相IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流

動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離以陰離子交換劑為例其交換過程可表示如下

X-溶劑中 (樹脂-R4N Cl-)=== 樹脂-R4N X-) Cl- 溶劑中

當交換達平衡時

KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-]

分配係數為

DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-]

[討論DX與保留值的關係]

凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離

離子對色譜法(Ion Pair Chromatography)

離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物從而控制溶質離子的保留行為其原

離子色譜儀流程示意

理可用下式表示X水相Y-水相 === X Y-有機相

式中X 水相--流動相中待分離的有機離子也可是陽離子Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對如氫氧化四丁基銨氫氧化十六烷基三甲銨等X Y---形成的離子對化合物

當達平衡時

KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相

根據定義分配係數為

DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相

[討論DX與保留值的關係]

離子對色譜法特別是反相解決了以往難以分離的混合物的分離問題諸如酸鹼和離子非離子混合物特別是一些生化試樣如核酸核苷生物鹼以及藥物等分離

離子色譜法(Ion Chromatography)

用離子交換樹脂為固定相電解質溶液為流動相以電導檢測器為通用檢測器為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾設置了抑制柱試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同

以陰離子交換樹脂(R-OH)作固定相分離陰離子如Br-為例當待測陰離子Br-隨流動相(NaOH)XX色譜柱時發生如下交換反應洗脫反應為交換反應的逆過程

擔體圖示

抑制柱上發生的反應

R-H Na OH- === R-Na H2O

R-H Na Br- === R-Na H Br-

可見通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水消除了本底電導的影響試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-可用電導法靈敏的檢測

離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法也可用於陽離子分析

空間排阻色譜法(Steric Exclusion Chromatography)

空間排阻色譜法以凝膠(gel) 為固定相它類似於分子篩的作用但凝膠的孔徑比分子篩要大得多一般為數納米到數百納米溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離而是按分子大小進行分離分離只與凝膠的孔徑分佈和溶質的流動力學體積或分子大小有關試樣XX色譜柱后隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過在試樣中一些太大的分子不能XX膠孔而受到排阻因此就直接通過柱子首先在色譜圖上出現一些很小的分子可以XX所有膠孔並滲透到顆粒中這些組分在柱上的保留值最大在色譜圖上最後出現

7流程 流程

流程如右圖所示溶劑貯器⑴中的流動相被泵⑵吸入經3梯度控制器按一定的梯度進行混合然後輸出經⑷測其壓力和流量導入(5進樣閥器經⑹保護柱⑺分離柱後到⑻檢測器檢測由⑽數據處理設備處理數據或⑾記錄儀記錄色譜圖⑿餾分收集器收集餾分⒀為廢液

8使用綜述色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之氰基或氨基鍵合硅膠也有使用離子交換填料用於離子交換色譜凝膠或玻璃微球等用於分子排阻色譜等注樣量一般為數微升除另有規定外柱溫為室溫檢測器為紫外吸收檢測器

在用紫外吸收檢測器時所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求

正文中各品種項下規定的條件除固定相種類流動相組分檢測器類型不得任意改變外其餘如色譜柱內徑長度固定相牌號載體粒度流動相流速混合流動相各組分的比例柱溫進 化學鍵合固定相反應

樣量檢測器的靈敏度等均可適當改變

以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求一般色譜圖約于20分鐘內記錄完畢

系統適用性試驗

按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整應達到規定的要求或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數分離度和拖尾因子.

色譜柱的理論板數 在選定的條件下注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液記錄色譜圖 化學鍵合固定相應用

量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數應改變色譜柱的某些條件如柱長載體性能色譜柱充填的優劣等使理論板數達到要求

分離度 定量分析時為便於準確測量要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度分離度(R)的計算公式為R=2(tR2-tR1)/(W1+W2) 式中 t(R2)為相鄰兩峰中后一峰的保留時間 t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間 W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬除另外有規定外分離度應大於1.5

拖尾因子為保證測量精度特別當採用峰高法測量時應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求拖尾因子計算公式為

W(0.05h) T=-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬

d1為峰極大至峰前沿之間的距離除另有規定外,T應在0.95~1.05間

也可按各品種校正因子測定項下配製相當於80%100%和120%的對照品溶液加入規定量的內標溶液配成三種不同濃度的溶液分別注樣3次計算平均校正因子其相對標準偏差應不大於2.0%

9測定定量測定時可根據樣品的具體情況採用峰面積法或峰高法但用歸一法或內標法測定雜質總量時須採用峰面積法

面積歸一化法 測定供試品或經衍生化處理的供試品中各雜質及雜質的總量限度採用不加校正因子的峰面積歸一法計算各雜質峰面積及其總和並求出占總峰面積的百分率但溶劑峰不計算在內色譜 硅膠

圖的記錄時間應根據各品種所含雜質的保留時間決定除另有規定外可為該品種項下主成分保留時間的倍數

主成分自身對照法 

當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時採用主成分自身對照法在測定前先按各品種項下規定的雜質限度將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液進樣調節檢測器的靈敏度或進樣量使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準確測量要求然後取供試品溶液進樣記錄時間除另有規定外應為主成分保留時間的倍數根據測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和並和對照溶液主成分的峰面積比較計算雜質限度

內標法 測定供試品中雜質的總量限度

採用不加校正因子的峰面積法取供試品按各品種項下規定的方法配製不含內標物質的供試品溶液注入儀器記錄色譜圖Ⅰ再配製含有內標物質的供試品溶液在同樣的條件下注樣記錄色譜圖Ⅱ記錄的時間除另有規定外應為該品種項下規定的內標峰保留時間的倍數色譜圖上內標峰高應為記錄儀滿標度的30%以上否則應調整注樣量或檢測器靈敏度

如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內標峰保留時間相同的雜質峰則色譜圖Ⅱ中各雜質峰面積之和應小於內標物質峰面積溶劑峰不計在內如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內標物質峰保留時間相同的雜質峰應將色譜圖Ⅱ上的內標物質峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質峰面積即為內標物質峰的校正面積色譜圖Ⅱ中各雜質峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積即為各雜質峰的校正總面積各雜質峰的校正總面積應小於內標物質峰的校正面積

加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量

按各品種項下的規定精密稱量取對照品和內標物質分別配成溶液精密量取各溶液配成校正因子測定用的對照溶液取一定量注入儀器記錄色譜圖測量對照品和內標物質的峰面積或峰高按下式計算校正因子

As/ms]校正因子f=- Ar/mr 式中 As為內標物質的峰面積或峰高,Ar為對照品的峰面積或峰高 ms為加入內標物質的量mr為加入對照品的量再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液注入儀器記錄色譜圖測量供試品或其雜質峰和內標物質的峰面積或峰高按下式計算含量Ax 含量(mx)=f×-As/ms 式中 Ax為供試品或其雜質峰面積或峰高 mx為供試品或其雜質的量fAs和ms的意義同上

當配製校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一分內標物質溶液時則配製內標物質溶液不必精密稱量取

外標法 測定供試品中某個雜質或主成分含量

按各品種項下的規定精密稱量取對照品和供試品配製成溶液分別精密取一定量注入儀器記錄色譜圖測量對照品和供試品待測成分的峰面積或峰高按下式計算含量

A 含量(mx)=mr×-Ar式中各符號意義同上

由於微量注XX器不易精確控制進樣量當採用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時以定量環進樣為好

10選型綜述要正確地選擇色譜分離方法首先必須盡可能多的 了解樣品的有關性質其 選型常用參照表

次必須熟悉各種色譜方法的主要特點及其應用範圍選擇色譜分離方法的主要根據是樣品的相對分子質量的大小在水中和有機溶劑中的溶解度極性和穩定程度以及化學結構等物理化學性質

相對分子質量對於相對分子質量較低一般在200以下揮發性比較好加熱又不易分解的樣品可以選擇氣相色譜法進行分析相對分子質量在200 ~ 2000的化合物可用液固吸附液-液分配和離子交換色譜法相對分子質量高於2000則可用空間排阻色譜法

溶解度水溶性樣品最好用離子交換色譜法和液液分配色譜法微溶於水但在酸或鹼存在下能很好電離的化合物也可用離子交換色譜法油溶性樣品或相對非極性的混合物可用液-固色譜法

化學結構若樣品中包含離子型或可離子化的化合物或者能與離子型化合物相互作用的化合物例如配位體及有機螯合劑可首先考慮用離子交換色譜但空間排阻和液液分配色譜也都能順利地應用於離子化合物異構體的分離可用液固色譜法具有不同官能團的化合物同系物可用液液分配色譜法對於高分子聚合物可用空間排阻色譜法

11設備綜述HPLC的出現不過三十多年的時間但這種分離分析技術的發展十分迅猛應用十分廣泛其儀器結構和流程多種多樣典型的高效液相色譜儀結構和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-4)高效液相色譜儀一般都具備貯液器高壓泵梯度洗提裝置用雙泵進樣器色譜柱檢測器恆溫器記錄儀等主要部件

高效液相色譜更適宜於分離分析高沸點熱穩定性差有生理活性及相對分子量比較大的物質因而廣泛應用於核酸肽類內酯稠環芳烴高聚物藥物人體代謝產物表面活性劑抗氧化劑殺蟲劑除莠劑的分析等物質的分析

高壓泵 實例

HPLC使用的色譜柱是很細的(1~6 mm)所用固定相的粒度也非常小幾μm到幾十μm)所以流動相在柱中流動受到的阻力很大在常壓下流動相流速十分緩慢柱效低且費時為了達到快速高效分離必須給流動相施加很大的壓力以加快其在柱中的流動速度為此須用高壓泵進行高壓輸液高壓高速是高效液相色譜的特點之一 儀器主要組成

HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件

a. 流量恆定無脈動並有較大的調節範圍一般為1~10 mL/min)

b. 能抗溶劑腐蝕

c. 有較高的輸液壓力對一般分離60×10^5Pa的壓力就滿足了對高效分離要求達到150~300×10^5Pa

⑴往複式柱塞泵

當柱塞推入缸體時泵頭出口上部的單向閥打開同時流動相XX的單向閥下部關閉這時就輸出少量的流體反之當柱塞向外拉時流動相入口的單向閥打開出口的單向閥同時關閉一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中這種泵的特點是不受整個色譜體系中其餘部分阻力稍有變化的影響連續供給恆定體積的流動相

⑵氣動放大泵

其工作原理是壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積 SA 活塞A 則在小面積 SB 活塞 B 輸出壓力XX至 p2 的液體壓力XX的倍數取決於 A 和 B 兩活塞的面積比如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 則壓力為 5 × Pa 的氣體就可得到壓力為 250×Pa 的輸出液體這是一種恆壓泵

梯度洗提類似於GC中的程序升溫已成為現代高效液相色譜中不可缺少的部分 氣動放大泵

梯度洗提就是載液中含有兩種或更多不同極性的溶劑在分離過程中按一定的程序連續改變載液中溶劑的配比和極性通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素以提高分離效果梯度洗提可以分為兩種

a.低壓梯度也叫外梯度在常壓下預先按一定程序將兩種或多種不同極性的溶劑混合后再用一台高壓泵輸入色譜柱

b.高壓梯度 ( 或稱內梯度系統 ) 利用兩台高壓輸液泵將兩種不同極性的溶劑按設定的比例送入梯度混合室混合後XX色譜