TH細胞

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簡介

  輔助性T細胞helper T cell),簡稱Th細胞,能分泌多種細胞因子。其中,Th1細胞參與細胞免疫和遲發性超敏性炎症反應;Th2可輔助B細胞分化抗體分泌細胞,參與體液免疫應答艾滋病病毒特異性地破壞Th細胞,導致患者免疫系統癱瘓。   Th細胞在免疫系統中起重要作用,有淋巴細胞吞噬細胞之間的抗原決定簇的傳遞,產生多種淋巴因子,產生白細胞介素,參與被感染細胞溶酶體酶酸性磷酸酶)的激活等作用。   Th細胞在免疫調節中起促進作用的是T細胞亞群。為單抗系列T4,CD4和Leu所識別,故亦稱T4細胞,其功能為產生多種細胞因子,傳遞抗原信息,促進T、B細胞分化增殖,輔助B細胞產生抗體和誘導遲發性變態反應。根據其表面單抗受體、所產生的細胞因子和功能不同又可分為TH1和TH2,TH1在誘導遲發性變態反應中起主要作用,故亦稱炎性T細胞 (inflammatory T cell T1)。   輔助性T細胞(helper T cell,Th)對機體的特異性免疫非特異性免疫均具有重要調節作用, 能協助B細胞產生抗體,也能促進其他T細胞的分化成熟,是機體內一類重要的免疫調節細胞。

特性及功能

  Th細胞是根據功能分類的一個T細胞亞群。據其分泌的細胞因子的不同可分為Th0、Th1、Th2 和Th3 四個亞型。Th1細胞主要分泌白細胞介素(interleukin,IL)-2,干擾素(interferon,IFN)-γ,IFN-a,腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-b等,主要介導細胞毒和局部炎症有關的免疫應答,輔助抗體生成,參與細胞免

TH細胞

疫及遲髮型超敏性炎症的發生,故稱為炎症性T細胞,可被視為相當於遲髮型超敏反應T細胞(TDTH細胞)。因而,Th1細胞在機體抗胞內病原體感染中發揮重要作用。   Th2細胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等,主要功能為刺激B細胞增殖併產生免疫球蛋白G(immunoglobulinG,IgG)1和免疫球蛋白E(immunoglobulinE,IgE)抗體,與體液免疫有關。少數Th細胞被稱為Th3細胞,他除分泌大量的IL-4和IL-10外,主要高表達TGF-b,但是不分泌IL-2和IFN-γ,可以下調抗原遞呈細胞(antigenpresenting cells,APC)及Th1細胞的活性,起免疫抑製作用。Th1, Th2和Th3細胞均由前體細胞Th0分化而來。未接觸抗原的T細胞被稱為Th細胞前體(Thcell precursor),他們通過接觸天然免疫細胞攝取的抗原而分化成一種不確定的狀態, 稱為Th0細胞。Th0細胞既分泌Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ,又分泌Th2型細胞因子IL-4,可在不同信號的刺激下分化為Th1或Th2細胞。Th1和Th2細胞除分泌不同的細胞因子,發揮不同的免疫作用外,他們各自細胞的表面受體也有許多的不同。   不同的表面受體不僅可以作為分離Th1/Th2細胞的表面標誌物,而且直接影響Th1/Th2細胞對一些細胞因子的反應能力,從而調控著Th1/Th2細胞的分化與功能(表1)。趨化因子受體CXCR-3和CCR-5的表達是Th1細胞的標記(優先表達于Th1細胞的分子有b2腎上腺能受體、淋巴細胞激活基因子3、CDW150、CD162、CD49f/CD29等),而CCR-3,CCR-4,CCR-7和CCR-8只能在Th2細胞表達,CD30也只與Th2細胞有關。Th1細胞持續表達免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin mucin 3,Tim-3)並可能通過半乳凝素類-9(Tim-3-galectin-9)途徑抑制Th1細胞介導的免疫反應和誘導外周免疫耐受

細胞分化和相互轉換

  機體正常時,Th1和Th2細胞功能處於動態平衡狀態,維持機體正常的細胞免疫和體液免疫功能;當機體受到異己抗原攻擊時,Th1和Th2細胞中某一亞群功能升高,另一亞群功能降低,該現象即為Th1/Th2漂移。 Th1和Th2細胞均從Th0細胞極化而來,Th0細胞向Th1或Th2細胞的極化可受到局部的細胞因子濃度、免疫活性激素、抗原的類型和濃度、抗原呈遞細胞的類型及細胞受體與主要組織相容性複合體(major histocompability complex,MHC)的親和力的強弱等多種因素的影響。   微環境中細胞因子的種類是影響Th細胞分化的關鍵因素。一般認為,Th細胞前體(Th cell precursor)在抗原的刺激下,分化為中間階段的Th0細胞,進而在不同的微環境中,Th0細胞選擇性分化為Th1或Th2細胞。

Th細胞檢測研究的現狀

  T淋巴細胞是高度異質性的群體,根據發育過程中出現的分化抗原的不同,分為CD4+ T和 CD8+ T細胞,這種分類對於區分T細胞的異質性有一定的價值,但隨著對T細胞功能研究的深入,人們發現,T細胞的功能主要是由其分泌的細胞因子介導的。   1986年Mosmann等根據小鼠的CD4+ T細胞克隆產生細胞因子類型的不同,將CD4+ T細胞發為TH1和TH2兩種類型,隨後Romagnani等人證實體內出存在相應的TH1和TH2亞群[1-2]。以表達白細胞介素2(IL-2)和γ干擾素(IFN-γ)為主的TH1群細胞,可以增強殺傷細胞的細胞的毒性作用激發遲髮型超敏反應,介導細胞免疫應答;以表達IL-4、IL-5、IL-10為主的TH2型細胞,促進抗體的產生,介導體液免疫應答,機體TH1、TH2平衡失調,與腫瘤免疫逃逸。   細菌、病毒等生物感染有一定的關係,並參與變態反應性疾病自身免疫性疾病移植排斥反應的發生,與傳統的臨床檢驗項目不同,檢測TH1、TH2相關細胞因子的意義,並不著重於輔助疾病的診斷,而更注重分析疾病發生髮展的狀況,為臨床調整TH1、TH2失衡提供正確的治療措施[3] 。由於目前尚無區分TH1和TH2細胞表面標誌物,所以只能根據細胞亞群分泌特徵性細胞因子的不同,間接檢測TH1和TH2細胞的數目和功能。

Th細胞胞外細胞檢測

  胞外細胞因子的檢測:主要檢測血漿血清)和其他本液中的細胞因子,血漿(血清)中細胞因子的測定。可確切反應細胞因子的表達狀態,某些體液標本如腦脊液滑膜組織液、支氣管灌洗液、胸腹水等與特定疾病直接相關。

1 生物活性檢測法

  是根據某些細胞因子特定的生物學活性,應用相應的批示系統和標準品來反映待測標本中某種細胞因子的活性水平,一般以活性單位來表示,我生物學檢測法一般敏感性較高,但實驗同期較長,如集落形成法需10~14d;易受細胞培養中某些因素的影響,如血清、pH、藥物;易受生物學活性相同或相近的其他細胞因子的影響,如檢測IL-2時可受IL-4的干擾,TNF-α和TNF-β(淋巴毒素)表現出極為相似的生物學作用;易受待檢樣品某些細胞因子抑制物的干擾,如IL-1的活性可被IL-1受體拮抗物(IL-lra)抑制,TNF-α可被TNF-BP阻斷;不能區分某些細胞因子的型和亞型,如IFN-α、β和γ,以及IFN-α中不同的亞型顯示相同的生物學活性;某些指示細胞因子的敏感性不同,所獲結果難於標準化,此外,某些人源的細胞因子如Hil-2對小鼠細胞起作用,但鼠源性的IL-2對人的細胞則無刺激作用,生物學檢測法大致可分為增殖可增殖抑制、集落形成、直接殺傷靶細胞、保護靶細胞免受病毒攻擊,趨化作用以及抗體形成法等幾種。

2 免疫學測定法

  基本原理是細胞因子(或受體)與相應的特異性抗體(單克隆抗體多克隆抗體)結合,通過放XX性同位素、熒光素或酶等標記技術加以放大和顯示,從而定性或定量顯示細胞因子(或受體)的水平。這類方法的優點是實驗周期短,少受抑制物或有相似功能的其他活性因子的干擾,可區分不同型或亞型的細胞因子(如IFN),一次能檢測大量標本,易標準化。與生物學活性檢測方法相比,免疫學檢測法在許多情況下敏感性低於前者,所得結果不表示生物學活笥,有的McAb只能識別重組的細胞因子,在檢測天然的細胞因子中受到限制。免疫學檢測的方法主要有RIA、ELISA、免疫熒光測定法和免疫發光測定法等,檢測中的標準品十分重要,美國國立癌症研究所生物反應調整專題(BRM P NCI)與英國國立生物標準化和控制研究所(NIBSC)被定為WHO細胞因子標準品提供機構,各國可以該標準品為依據製備相應的參考標準品,結果以pg/ml或ng/ml表示,從而使資料共享[4]。

Th細胞胞內細胞檢測

  Schauer等[5] 對胞內細胞因子的測定作出綜合評價,標本來源包括末梢血單個核細胞、腫瘤細胞、組織細胞等,檢測方法常用免疫組化法,主要為鹼性磷酸酶抗鹼性磷酸酶(APAAP)技術[6] 和測定mRNA的熒光原位雜交技術(FISH),此外還有顯微熒光法,將單個細胞用多聚甲醛固定皂素滲透后,行間接免疫熒光染色,以及Schauer等[5]介紹的用刺激劑PMA(佛波酯)和Ionomycin刺激細胞,使細胞因子向高爾基體積聚,用BFA或Monensin阻斷細胞因子向胞膜外轉運,然後用流式細胞儀檢測的方法,總的來說 TH1型細胞因子的檢測相對容易,因為TH1型細胞能表達大量IL-2或IFN-γ,而TH2型細胞因子如IL-4、IL-5、IL-10的檢測相對困難,主要原因是TH2型細胞在標本中的出現頻率較低,所以有人建議用CD45RO+ 細胞來代替TH2的檢測 [6]。

1 酶聯免疫點法

  (enzme-linked immunospot assay,ELISP)將抗細胞因子抗體包被反應板,加入待測T細胞,孵育一段時間后,加酶標記抗細胞因子抗體的酶作用底物,通過細胞的比色印跡法檢測信號,最後通過圖像掃描或專用的酶標儀進行分析。ELISPOT法引入生物素,親合素放大系統后,靈敏度大為提高,在測定產生細胞因子陽性細胞頻度方面,與流式細胞儀法相平行,但后教養可同時描述細胞性質和其他因子的產生情況,且結果更為客觀,ELISPOT法一般雙ELISA夾心法靈敏,因為其充分利用細胞因子在細胞分泌部位聚集濃度高的特點,並且ELISPOT法能夠對每個細胞的分泌物定量[4]。

2 核酸雜交法

  這是一類利用細胞因子的基因探針檢測特定細胞因子基因表達的技術,絕大多數細胞因子mRNA在T細胞中只短暫存在,其存在的量與T細胞產生細胞因子的量有很好的相關性,所以,在大多數情況下,細胞內mRNA的量可以反映細胞產生細胞因子的情況,目前反有公認的細胞因子的基因均已克隆化,故能較容易地得到某一細胞因子的cDNA探針或根據已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探行,利用基因探針檢測細胞因子mRNA表達的方法多種多樣,常使用斑點雜交Northern blot、逆轉錄PCR、細胞或組織原位雜交等。實驗的關鍵在於製備高質量的核酸探針和獲得合格的待測物(提取的mRNA樣品或細胞/組織標本)。核酸探針是指一段用放XX性同位素或其他標記物(如生物素、地高辛等)標記並與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA、RNA。根據其來源可分為cDNA探針、寡核苷酸探針和人工合成寡核苷酸探針常用於斑點雜交及Northerm blot,而RNA探針因穿透性好更適用於原位雜交。核酸探針技術的應用已經程序化,以cDNA探針為例主要包括:質粒DNA的提取;靶DNA自段的分離;靶DNA片段標記;待測樣品mRNA的提取,標記cDNA探針對待檢樣品的雜交;放XX自顯影或顯色分析。近年來RT-PCR檢測特異性mRNA的方法廣泛用於細胞因子研究領域。該法具有靈敏、快速等優點,甚至從1~10個細胞中就可檢出的特異mRNA,適於科研或臨床檢測[4]。

3 流式細胞儀檢測法

  流式細胞術flow cytkmetery,FCM)其基本原理是:用刺激劑PMA、ionomycin離子霉素)體外激活淋巴細胞,用蛋白轉運抑制如黃能霉素(monensin)阻止細胞因子分泌到細胞外,細胞內蛋白質轉運方式被打亂,引起細胞因子向高爾基體積聚,用流式細胞儀便可測出增強細胞因子。這一技術的發展使得以往通過T細胞克隆方式在幾個月才能回答的問題,在幾個小時內就能得以解決。該技術成為單細胞水平上檢測細胞因子產生的標準分析方法,儘管細胞因子標記流式細胞技術具有其他方法無可比擬的優越性,但是在操作過程中,需要對細胞進行刺激、阻斷、固定、穿透和標記,任何一個環節都會影響實驗結果[8]。流式細胞儀法常用檢測指標為以CD4設門進行FCM分析。通過CD4+ 細胞中IFN-γ和IL-4的表達來確定TH1/ TH2細胞的百分率[9-10]。以CD3/CD8設門,用FCM檢測分析TH1/ TH2細胞的表達率,結果準確可靠,操作方便快捷,是檢測TH1/ TH2細胞較理想的方法[11-12]。近年來發現CD4+T細胞向不同的方向極化,細胞表面表達不同趨化因子受體(chemokine receptor),趨化因子受體CCR5主要表達于TH1細胞表面,是TH1細胞的特異性標記[14],因此,利用針對趨化因子受體的特異性單克隆抗體來測定TH不同亞群特異笥較高,而且操作較簡單。CCR5和CCR3抗體是最近開發出來的,但只能反映TH細胞數量上的變化,其與功能(細胞因子分泌)的變化不否一致,有待進一步的研究。

結語

  ELISA法和生物活性法是測定的細胞因子的總量或總的活性,不能區分細胞因子的型和亞型,操作繁瑣,難於標準化,ELISPOT法測定的是TH1和TH2細胞的數目與單個細胞分泌細胞因子量的差異,靈敏度較ELISA法高,核酸雜交檢測法反映的是細胞因子基因的量,要獲得高質量的探針和合格的標本較困難,該法更適用於科研。流式細胞儀法檢測的是TH1和TH1的數目,檢測速度快,但只能反映TH細胞數量上的變化,其與功能(細胞因子分泌)上的變化是否一致,有待進一步的研究。