抗凝劑

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應用物理或化學方法,除掉或抑制血液中的某些凝血因子,阻止血液凝固,稱為抗凝。能夠阻止血液凝固化學試劑物質,稱為抗凝劑或抗凝物質。 如天然抗凝劑(肝素水蛭素等) Ca+2鰲合劑檸檬酸鈉,氟化鉀

基本信息

  抗凝劑   醫療用途治療靜脈炎,阻止血塊在靜脈里形成。   體育用途:避免促細胞生成素使血液變稠。   應用物理或化學方法,除掉或抑制血液中的某些凝血因子,阻止血液凝固,稱為抗凝。能夠阻止血液凝固的化學試劑或物質,稱為抗凝劑或抗凝物質。   如天然抗凝劑(肝素,水蛭素等)   Ca+2鰲合劑(檸檬酸鈉,氟化鉀)   原理:使凝血酶原不能激活,Ca+2是凝血因子IV,其他的是蛋白類。

種類

乙二胺四乙酸

  乙二胺四乙酸(EDTA)鹽 EDTA有二鈉、二鉀和三鉀鹽。均可與離子結全成螯合物,從而阻止血液凝固。   EDTA鹽對紅、白細胞形態影響很小,根據國際血液學標準公委員會(International committee standard of hematology ,ICSH)1993年文件建議,血細胞計數用EDTA二鉀作抗凝劑,用量為EDTA-K2。2H2O1.5-2.2MG (4.45±0.85μmol)/ml血液。EDTA-NA與EDTA-K2對血細胞計數影響均較小,但二鈉溶解度明顯低於二鉀,有時影響抗凝效果,其他抗凝劑不適合於血細胞計數。表1-1是幾種抗凝劑對白細胞計數的影響,EDTA影響小板聚集,不適合於作凝血象檢查和血小板功能試驗

草酸鈉

  草酸鈉(sodium oxalate)草酸鹽可與血中鈣離子生成草酸鈣沉澱,從而阻止血液凝固。

肝素

  肝素(heparin)肝素廣泛在於肺、肝、脾等幾乎所有組織和血管周圍肥大細胞和暑鹼性粒細胞顆粒中。它是一種含硫酸基團的粘多糖,是分散物質,平均分子量為15000(2000-40000)。肝素可加強抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)滅活絲氨酸蛋白酶,從而具有阻止凝血酶形成,對抗凝血酶和阻止血小板聚集等多種作用。每毫升血液抗凝需要持素15±2.5IU 。儘管肝素可以保持紅細胞的自然形態,但由於其常可引起白細胞聚集關使用塗片在羅氏()染色時產生藍色背景,因此肝素抗凝血不適全血液學一般檢查。肝素是紅細胞透滲脆性試驗理想的抗凝劑。

枸櫞酸

  枸櫞酸鈉(trisodium citrate)枸櫞酸鹽可與血中鈣離子形成可溶性螯合物,從而阻止血液凝固。   枸櫞酸鈉有2Na3C6H5O7。和2Na3C6H5。11H2O等多種晶體。通常用前者配成109mmol/l(32g/l)水溶液(也有用106mmol/l濃度),與血液按1:9或1:4比例使用。枸椽鈉對凝血V因子有較好的保護作用,使其活性減低緩,故常用於凝血象的檢查,也用於紅細胞沉降率的測定。因毒性小,是輸積壓保養中的成分之一。[1]

臨床應用

EDTA

  EDTA是臨檢工作中最常用和最重要的抗凝劑和試劑之一,其機制是通過與水相中的鈣離子形成穩定的螯合物而阻止血液凝固。EDTA的鹽類有鉀、鈉、鋰鹽、均溶於水,鉀鹽較鈉鹽的溶解度大,全血胞計數最好使用EDTA的鉀鹽。EDTA能影響某些酶的活性和抑制紅斑狼瘡因子,故不適於製作組化染色和檢查紅斑狼瘡細胞血塗片。EDTA還會影響血小板聚集和白細胞吞噬功能,也不適於做止血學檢驗和血小板功能檢驗。用EDTA抗凝血製備的塗片對粒細胞形態有影響,其影響程度與抗凝血放置時間和抗凝劑濃度有關。按照ICSH建議EDTA的使用濃度為1.4~1.6g/L血液,迅速製備塗片,粒細胞形態特徵有微小的改變,有時細胞核分葉不見,細胞腫脹。如果用放置時間較長的血液製備的塗片可出現細胞漿內顆粒消失,胞漿和細胞核有空泡,染色質模糊不清。用大於1.5g/L血液濃度製備的血塗片,粒細胞可完全變性,對淋巴細胞單核細胞也有影響,尤其是血小板,可出現腫脹、XX而產生碎片,影響其計數,造成結果偏高。獲得血漿標本可通過不同的抗凝劑,肝素鋰作為抗凝劑在國外應用廣泛,而國內多使用肝素鈉、EDTA-K2抗凝,與國外有所不同。隨著臨床醫學發展,近年來糖化血紅蛋白檢測項目的開展,也使用了EDTA-K2作為抗凝劑,從而減少了對結果的影響。

肝素

  肝素是血液化學成分測定中最好的抗凝劑。肝素是一種含硫酸基團的黏多糖,分子量為1.5萬,其抗凝機制是與抗凝酶Ⅱ一起,在低濃度能抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之間的作用,並能加強抗凝血酶Ⅲ滅活絲氨酸蛋白酶,從而阻止凝血酶形成;還有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。肝素的鹽類有鈉、鋰、銨鹽。通常用肝素抗凝的劑量是10.0~12.5IU/mL血液。臨床常用肝素鋰,雖其價格較貴,但抗凝效果較好。因為肝素鈉能增加血漿鈉的含量,而肝素銨能增加尿素氨的含量。某些生化成分在血清和肝素抗凝的血漿中有明顯的區別。在凝血過程中由於紅細胞的溶解破壞使血清鉀的含量比血漿為高,由於血漿中含有Fg,其含量比血清高。因此,測定鉀離子時,注意血清與血漿之間的差異。另外肝素過量可引起白細胞聚集和血小板減少,故不適於白細胞分類血小板計數,更不能用於止血學檢驗。通過試驗表明,采血時加入肝素鈉抗凝劑后,對測定血液中總蛋白質含量結果有較明顯的影響,會使其測得結果高於用血清測得總蛋白質3%~5%。但加入了抗凝劑后,其總蛋白含量低於血清總蛋白質含量,其原因是血液加入肝素鈉抗凝劑后,阻斷了凝血活酶的生成,阻止了血液凝固,導致纖維蛋白原不能水解轉化成纖維蛋白單體,有效阻止了纖維蛋白單體的形成,這些纖維蛋白原仍留在血漿中。而血清是血液經凝固后,纖維蛋白原水解轉化為纖維蛋白單體,並因凝固而消耗,離心后隨血細胞一併分離出去了。因此,血漿中的總蛋白質量是包含了纖維蛋白原在內的所有蛋白質,而血清中是不含有纖維蛋白原的總蛋白質含量,理論上應該低於血漿中的總蛋白含量。因此在進行血液總蛋白質含量測定時,最好以血清為標本,對一些急診標本,或是一些因其他原因急需測定的患者,需要用血漿做標本測定總蛋白時,在測出總蛋白后,應扣除纖維蛋白原的含量(一般扣除3%~5%),這樣才能與以血清為標本測得的總蛋白含量一致,真實反映患者體內實際總蛋白質之含量。

枸櫞酸鹽

  枸櫞酸鹽主要用於止血學檢驗及血沉的測定。因其毒性小,也用於輸血保養液中。其抗凝機制是枸椽酸鹽與血中鈣離子形成可溶性螯合物,從而阻止血液凝固,其反應式為Na3C6H5O7+Ca2+→CaC6H5+3Na+。其鹽類主要是鈉鹽。枸緣酸鈉有Na3C6H5O7ZH?5O和2Na3C6H5O7+1H2O2種晶體,通常用前者配製0.129 mol/L(3.8%)或0.109mol/L(3.2%)的血溶液,與血液按1:9使用。對於用於監測口服華法令等抗凝劑治療的患者,測定PT、APTT所用的枸緣酸鈉濃度(3.2%或3.8%)不應隨意改變,因為可能影響到國際標準化比值(INR)。一般用濃度0.129mol/L的枸緣酸鈉比用0.109mol/L濃度時INP值要高些,另外對不同來源的凝血活酶試劑,對同一正常人或患者血漿的凝固時間可以相差很大。因此每個實驗室所使用的凝血活酶試劑的來源應盡可能恆定,配製操作方法應規範化,否則會使凝固時間延長或縮短,或使正常值無規律性。有條件的實驗室可採用緩衝抗凝劑,這種試劑對標本經冷凍保存后再進行分析更為適宜。緩衝劑的作用是維持血漿恆定pH值,防止易變因子失活。[2]

配製

EDTA

  常用EDTA的鈉鹽或鉀鹽作為抗凝劑,能與血液中的鈣離子結合成螯合物,而是鈣離子失去凝血作用,從而阻止血液凝固。

肝素

  1%肝素溶液0.1ml于試管內,旋轉試管,使溶液均勻浸濕試管內壁,放入80~100℃烘箱烤乾,每管能使5~10ml血液不凝。急性血壓實驗時可在充滿生理鹽水動脈套管內注入肝素20~25mg。體內抗凝:500~1000u/kg。 市售的肝素注XX液每1ml含肝素12500u(相當於肝素鈉125mg,即1mg相當於100u)。應置冰箱內保存。

枸櫞酸鈉

  枸櫞酸鈉 3.8%的枸櫞酸鈉溶液1份可使9份血液不凝,用於紅細胞沉降速率的測定。因其抗凝血作用較弱而鹼性較強,不適用於供化驗用的血液樣品。做急性血壓實驗時則用5~7%的枸櫞酸鈉溶液。

草酸鉀

  草酸鉀常用於供檢驗用血液樣品的抗凝。在試管內加飽和草酸鉀溶液2滴(或10%溶液0.2ml),輕輕敲擊試管,使溶液分散到管壁四周,置80℃以下的烘箱中烤乾(烘烤溫度過高,可使草酸鉀分解碳酸鉀失效),每管能使3~5ml血液不凝。供鉀、鈣含量測定的血樣不能用草酸鉀抗凝。   關於保存:新鮮冰凍血漿在-20℃以下可保存1年 [3]

原理

  使凝血酶原不能激活,Ca+2是凝血因子IV,其他的是蛋白類》. 離心技術是根據顆粒在勻迷圓周運動時受到一個外向的離心力的行為發展起來的一種分離分析技術。   1.用於工業生產的,如化工、製藥、食品等工業大型製備用的離心技術,轉速都在每分鐘5000轉以下。 2.用於生物、醫學、化學等實驗室分析研究的,轉速從每分鐘幾千到幾萬轉以上,此類技術的使用目的在於分離和純化樣品,以及對純化樣品的有關性能進行研究。   一、基本原理   1.離心力Centrifugal force (F) F=mω2r ω:旋轉角速度(弧度/秒) r:旋轉體離旋轉軸的距離(cm) m:顆粒質量   2.相對離心力 Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是實際離心力轉化為重力加速度的倍數 RCF=F離心力/F重力 = mω2r/mg= ω2r/g g為重力加速度(980.70g/sec2) 同為轉于旋轉一周等於2π弧度,因此轉子的角速度以每分鐘旋轉的次數(每分鐘轉數n或r/min)表示: 一般情況下,低速離心時常以r/min來表示,高速離心時則以g(或數字Xg)表示。 用「X g」表示每分鐘轉速可以真實反映顆粒在離心管不同位置的離心力。Dole&Cotzias製作了轉子速度和半徑相對應的離心力列線圖(圖2—15)。   3.沉降係數 Sedimentation coefficient (S) 當轉子內樣品繞著旋轉軸離心時,樣品沉降率是由樣品顆粒的大小、形狀、密度溶劑的粘度、密度以及離心加速度決定的,在一般情況下,樣品的沉降特徵可以用沉降係數來表示: S:是指單位離心場中粒子移動的速度。 S的物理意義是顆粒在離心力作用下從靜止狀態到達等速運動所經過的時間。 S在實際應用時常在10-13秒左右,故把沉降係數10-13秒稱為一個Svedberg單位,簡寫S,單位為秒,1S二1×10-13秒。對一定的樣品,在一定的介質中,樣品沉降係數S也常保持不變。文獻中常用沉降係數以描述某些生物大分子或亞細胞器大小。   二、離心設備 離心技術所使用的設備是由離心轉子、離心管及附件等組成。   (一)離心機   1. 低速離心機 一般最高轉速在6000r/min以下。實驗室中常用於分離製備。   2.高速離心機 帶有能夠冷卻的離心腔製冷設備,這類離心機的速度控制比上述的低速離心機來得準確,工作時的實際速度和溫度可通過儀錶顯示;配有一定類型及規格的轉子,可根據需要選用。此類離心機的最高轉速在25000r/min以下,常用於生物大分子的分離製備。   3.超速離心機 由四個部分組成,即驅動和速度控制;溫度控制;真空系統以及轉于。至今超迷離心機最高轉速為85000-/min(可達600,000g左右)。常用於分離亞細胞器、病毒粒于、DNA、RNA和蛋白質分于,在分離時無須加入可能引起被分離物質結構改變的物質,故為觀察它們的「天然」結構與功能提供了手段。   (二)轉子 主要有三種: 固定角式轉子(fixed—angle rotor);水平轉子(swing—out rotor);垂直轉子(vertical rotor),還有帶狀轉子(zonal rotor)和連續轉于(continuous rotor)等。   1.固定角式轉子   離心管在離心機中放置的位置與旋轉軸心形成一個固定的角度,角度變化在14—40°之間,常見的角度有20°、28°、34°及40°等。 因角式轉子的重心低,轉速可較高,樣品粒子穿過溶劑層的距離略大於離心管的直徑;又因為有一定的角度,故在離心過程中撞到離心管外壁的粒子沿著管壁滑到管底形成沉澱,這就是「管壁效應」,此效應使最後在管底聚成的沉澱較緊密。   2.水平轉子   此類轉于靜止時,處在轉子中的離心管中心線與旋轉軸平行,而在轉子旋轉加速時,離心管中心線由平行位置逐漸過渡到垂直位置,即與旋轉軸成90『角,粒子的沉澱方向同旋轉半徑方向基本一致,但也有少量的「管壁效應」。 由於此類轉予的重心位置較高,樣品粒子沉降穿過溶劑層的距離大於直徑。它對於多種成分樣品分離特別有效,常用於速率區帶離心和等密度離心。   3.垂直轉子   離心管垂直XX轉于孔內,在離心過程中始終與旋轉軸子行,而離心時液層發生90°角的變化,從開始的水平方向改成垂直方向,轉子降速時,垂直分佈的液層又逐漸趨向水平,待旋轉停止后,液面又完全恢復成水平方向。這是因為在進行密度梯度離心前,由於重力的作用,垂直轉予的粒子沉澱距離等於離心管的直徑,離心分離所徭的離心力最小,適用於速率區帶離心和等密度離心,但一般不用於差速離心。   三、離心分離方法   根據離心原理,按照實際工作的需要,目前已有可設計出各種離心方法綜合起來大致可分三類   1. 平衡離心法   根據粒子大小、形狀不同進行分離,包括差速離心法(differential velocity centrifugation)和速率區帶離心法(rate zonal centrifugation)。   2.等密度離心法(isopynic centrifugation)   又稱等比重離心法,根據粒子密度差進行分離,等密度離心法和上述速率區帶離心法合稱為密度梯度離心法。   3.經典式沉降平衡離心法   用於對生物大分子分子量的測定、純度估計、構象變化。   (一)差速離心法   它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別,在同一離心條件下,沉降速度不同,通過不斷增加相對離心力,使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分步沉澱。操作過程中一般是在離心后傾倒的辦法把上清液與沉澱分開,然後將上清液加高轉速離心,分離出第二部分沉澱,如此往複加高轉速,逐級分離出所需要的物質。 差速離心的解析度不高,沉澱係數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開,常用於其他分離手段之前的粗製品提取。   2.注意點:   ①可用角式、水平式轉頭   ②可用剎車   ③難以獲得高純度 例:用差速離心法分離已破碎的細胞各組份   (二)速率區帶離心法   1.原理   速率區帶離心法是離心前在離心管內先裝入密度梯度介質(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等),待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間,同梯度液一起離心。離心后在近旋轉軸處的介質密度最小,離旋轉軸最遠處介質的密度最大,但最大介質密度必須小於樣品中粒于的最小密度。這種方法是根據分離的粒子其在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的粒子處於不同的密度梯度層內分成一系列區帶,達到彼此分離的目的。 梯度液在離心過程中以及離心完畢后,取樣時起著支持介質和穩定劑的作用,避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。 該離心法的離心時間要嚴格控制,即有足夠的時間使各種粒子在介質梯度中形成區帶,又要控制在任意一個粒子達到沉澱前。如果離心時間過長,所有的樣品可全部到達離心管底部;離心時間不足,樣品還沒有分離。由於此法是一種不完全的沉降,沉降受物質本身大小的影響較大,一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。   2.注意點:   ①嚴格控制離心時間   ②粒子密度大於介質密度   ③樣品事先配製在較平緩的連續密度的梯度溶液   ④不能用角式轉頭、只能用水平式轉頭   ⑤不能用剎車   (三)等密度離心法   1.原理   等密度離心法是在離心前預先配製介質的密度梯度,此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度,待分離的樣品鋪在梯度液或和梯度液先混合,離心開始后,當梯度液由於離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度,與此同時原來分佈均勻粒子也發生重新分佈。當管底介質的密度大於粒子的密度,粒子上浮;在彎頂處粒子密度大於介質密度時,則粒子沉降,最後粒子XX到一個它本身的密度位置即粒子密度等於介質密變,此時dr/dt為零粒子不再移動,粒子形成純組分的區帶,與樣品粒子的密度有關,而與粒子的大小和其他參數無關,因此只要轉速、溫度不變,則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。   2.注意點:   ①離心時間要長   ②可用角式轉頭或水平式轉頭   ③粒子密度相近或相等時不宜用   ④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度   ⑤不能用剎車   四、梯度溶液的製備   (一)梯度材料的選擇原則:   1.與被分離的生物材料不發生反應,且易與所分離的生物材料分開。   2.可達到要求的密度範圍,且在所要求的密度範圍內,粘度低,滲透壓低,離子強度和pH變化較小。   3.不會對離心設備發生腐蝕作用。   4.容易純化,價格便宜或容易回收。   5.濃度便於測定,如具有折光率。   6.對於分析超迷離心工作來說,它的物理性質,熱力學性質應該是己知的。   (二)梯度材料的應用範圍 下面簡單介紹幾種常用的密度梯度材料的性質及其應用範圍。   1.蔗糖:水溶性大,性質穩定,滲透壓較高,其最高密度可達1.33g/ml,且由於價格低,容易製備,是現在實驗室里常用於細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料,但由於有較大的滲透壓,不宜用於細胞的分離。   2.聚蔗糖:商品名Ficoll,常採用Ficoll—400也就是相對分子重量為400000,Ficoll滲透壓低,但它的粘度卻特別高,為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用於分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞腫瘤細胞、鼠肝細胞等。   3.氯化銫:是一種離於性介質、水溶性大,最高密度可達1.91g/nd。由於它是重金屬鹽類,在離心時形成的梯度有較好的解析度,被廣泛地用於DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離,但價格較貴。   4.鹵化鹽類:KBr和NaCI可用於脂蛋白分離,KI和NaI可用於RNA分離,其解析度高於銫鹽。NaCl梯度也可用於分離脂蛋白,NaI梯度可分離天然或變性的DNA。   5.Percoll: 是商品名,它是一種SiO2膠體外麵包了一層聚乙烯吡咯酮(PVP),滲透壓低,它對生物材料的影響小,而且顆粒穩定,在冷卻和凍融情況下還是穩定的。其粘度高,在酸性pH和高離子強度下不穩定。它可用於細胞、細胞器和病毒的分離。   五、分析性超速離心   與製備性超速離心不同的是:分析性超速離心主要是為了研究生物大分子的沉降特性和結構,而不是專門收集某一特定組分。因此它使用了特殊的轉子和檢測手段,以便連續地監視物質在一個離心場中的沉降過程。   分析性超速離心的工作原理: 分析性超速離心機主要由一個橢圓形的轉子,一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸聯接一個高速的驅動裝置,這軸可使轉于在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉,其容納二個小室:分析室和配衡室有上下二個平面的石英窗,離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質,可以通過對紫外光吸收(如對蛋白質和DNA)或折XX率的不同對沉降物進行監視,后一方法的原理是:當光線通過一個具有不同密度區的透明液時,在這些區帶的界面上產生光的折XX。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就象一個折XX的透鏡,結果在檢測系統的照相底板上產生一「峰」。由於沉降不斷進行,界面向前推進,故「峰」也在移動,從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標.