細胞組織

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微繁殖技術,即以植物的器官組織細胞原生質體為外植體,在離體培養條件下進行植株再生的技術。應用微繁殖技術既可用於克服高度雜合物種因有性繁殖而引起的後代嚴重分離,如澳大利亞的番木瓜;又可用於名優或瀕危物種的快速繁殖,如鳳梨、草莓。通過微繁技術已獲再生植株的樹種主要有番木瓜、柑橘龍眼荔枝蘋果、梨、葡萄等,草莓、香蕉等,已實現了商品化生產。

細胞工程在植物方面的應用

微繁殖技術(Micropropagation)的應用

  通過莖尖培養或微嫁接技術,可以脫去植物體內病毒,獲得無病毒苗木,如蘋果、草莓等。另外,在組織培養過程中,如愈傷組織培養、細胞懸浮培養、原生質體培養等,通過pH值、溫度、離子濃度等條件的變化,可增加其變異,從中可篩選出優良的突變體,從而為新品種的選育開闢一條嶄新的途徑。   愈傷組織、懸浮細胞、原生質體等是基因轉化的良好受體材料,並且在離體培養條件下進行植株再生也是實現植物遺傳轉化的重要環節。   此外,微繁技術為種質的保存(germplasm storage)提供了新方法。很多種質資源在離體培養條件下,通過減緩生長低溫處理而達到長期保存目的,並可進行不同國家、地區間的種質資源收集、互換、保存和應用,即建立「基因銀行」(gene bank),實現種質資源的全球共享。例如,在比利時Catholic University的Leuven研究中心有大量離體保存的香蕉種質庫。

細胞大量培養與有用次生代謝產物生產

  細胞大量培養有用次生代謝產物是植物細胞工程另一個重要應用領域。通過細胞工程技術,刺激植物體內某些重要次生代謝產物的合成積累,然後進行分離、提純,如某些名貴藥物、香精、色素等,實現植物產品的工業化生產。   早在1964年我國就開始進行人蔘細胞培養。1980年以後,我國研究者相繼開展了紫草三七紅豆杉青蒿紅景天水母雪蓮等植物的細胞大量培養和研究,並利用生物反應器進行藥用植物的細胞大量培養的小試和中試。其中新疆紫草中試的規模達到100L,並小批量生產了紫草素,用於研製化妝品抗菌抗病毒和抗腫瘤藥物。紅豆杉細胞大量培養在我國也獲得初步成功,從細胞培養物中得到了珍貴的抗癌藥物紫杉醇,但產率還有待提高

單倍體(Haploid)技術的應用

  單倍體育種和相關研究在農業和園藝植物中得到了廣泛的應用。用Blakeslee等(1922年)和Kostoff(1941年)分別得到了單倍體植株單倍體有利於突變的檢測和抗性細胞系的篩選,並且大大縮短了育種的時間。此外單倍體在基因圖譜基因轉移研究中具有重要作用。   自然形成的單倍體是極少見的,並且僅限於幾種植物。花藥培養是單倍體形成的重要途徑。自1964年第一例花藥培養獲得成功以來,花藥培養技術已取得了顯著的進展,尤其在水稻小麥、玉米等作物中已獲得巨大成功。現已取得成功的果樹樹種主要有番荔枝(Nair等,1983年)、番木瓜(Litz和Conover,1978年)、4個柑橘品種(Chen,1985年)、龍眼(Yang和Wei,1984年)、荔枝(Fu和Tang,1983年)、蘋果(Zhang等,1990年)、梨(Jordan,1975年)、葡萄(Rajasekaran和Mullins,1979年)等。薛光榮等(1980年)對東方草莓(四倍體)的單核期花粉進行培養,成功的誘導出單倍體植株。   花藥培養主要是受基因型、花藥的發育階段、預處理和培養條件的影響,其存在的主要問題是單倍體的誘導頻率低,單倍體自發加倍形成的二倍體體細胞組織形成的二倍體很難區分。例如,Fowler等(1971年)、Nishi等(1974年)和Rosati等(1975年)以八倍體草莓花藥為材料誘導愈傷組織,並分化出植株,發現其再生植株仍為八倍體,這些八倍體是由無性器官發育而來,還是由單倍體自發加倍而成則難以區分。   除花藥培養外,植物的卵細胞、助細胞、反足細胞等單倍體細胞通過離體培養可以分化成單倍體胚或愈傷組織。胚珠、子房培養也曾進行了大量嘗試,但大多數情況下,在愈傷組織階段生長停止。

胚培養(Embryo culture)

  胚的離體培養是直接應用於植物改良最早的組織培養技術。胚培養可以克服雜交后胚的衰亡,保證種內或種間雜交的成功,或用於無性繁殖困難的植物的培養。胚培養還可以克服種子的休眠和敗育。Magdalita等(1996年)和Drew等(1997年)分別進行了番木瓜的種內雜交,得到合適的胚子后,進行了胚培養,以促進雜交成功。Jordan(1992年)得到了愈傷組織,但未得到再生植株。   澳大利亞國際農業技術研究中心對番木瓜和其野生種的雜交胚進行了培養研究,已獲成功,並得到了雜交後代,野生種的抗性、高含糖量等優良性狀得到了遺傳。荔枝是較難進行離體培養的果樹樹種之一,Kantharajah等(1992年)培養了長度為3mm的荔枝幼胚。其他通過未成熟胚培養進行再生的樹種有鱷梨、番荔枝和番木瓜等。姚強(1990年)對桃、油桃和番桃花后60d的未成熟胚進行培養,獲得了再生植株。J.Button等(1975年)利用甜橙種胚愈傷組織離體培養獲得了完整植株。

原生質體培養

  (Protoplast culture)與體細胞雜交(Somatic hybridization)原生質體是去掉細胞壁的單細胞,它是在離體培養條件下能夠再生完整植株的最小單位。每個原生質體都含有該個體的全部遺傳信息,在適宜的培養條件下,具有再生成與其親本相似的個體的全能性。原生質體培養的主要目的是通過原生質體的融合,克服遠緣雜交障礙,實現體細胞雜交,從而產生雜交後代。在原生質體培養過程中,往往產生大量的變異,可從中選擇優良突變體。原生質體可以攝取外源細胞器、病毒、DNA等各種大分子遺傳物質,是進行遺傳轉化的理想工具,此外,在同一時間內獲得的大量原生質體在遺傳上是同質的,可為細胞生物學發育生物學、細胞生理學細胞遺傳學及其他一些生物學科建立良好的實驗體系。   Lizz(1986年)曾分離得到番木瓜的原生質體,Krikorian等(1988年)分離得到了香蕉的原生質體,但二者均未得到持續分裂的細胞。Nyman等(1987年,1988年)首先報道了草莓栽培品種Sengana和Canaga試管苗葉肉原生質體培養及植株再生。1992年,他們獲得了草莓試管苗幼葉和葉柄原生質體的再生植株。Infante等以森林草莓用(Fragaria vesca)Alpine營養系試管苗葉片和葉柄為材料分離原生質體,並獲得了再生植株。愈傷組織和懸浮細胞是製備原生質體的重要材料,但在落葉果樹上,只有少數樹種利用愈傷組織或懸浮細胞分離原生質體並獲得培養的成功,其中最成功的樹種當屬獼猴桃。蔡起貴等(1988年)通過愈傷組織分離出中華獼猴桃的原生質體,並獲得了再生植株。Kovalenko等(1990年)和Ochatt等(1988年)分別在Colt櫻桃和歐洲葡萄上利用懸浮細胞系分離原生質體並獲得再生植株。   林定波等(1997年)以胚性愈傷組織為材料,分離得到錦橙的原生質體,並獲得了再生植株。易干軍等(1997年)也以胚性愈傷組織為材料,分離得到柑橘(紅江橘)的原生質體,並獲得再生植株。但以葉肉為材料分離得到的原生質體未獲得成功。馬鋒旺等(1998年)對山杏的原生質體進行了分離和培養,在適宜條件下,山杏原生質體4~5d變形,5~6d開始第一次分裂,20d左右可形成15~20個細胞的小細胞團,60d后可形成肉眼可見的微愈傷組織。微愈傷組織經繼代培養后,可誘導不定芽和不定根,形成完整植株。丁愛萍等(1994年)曾對蘋果進行了原生質體培養和植株再生研究,以胚性愈傷組織建立的懸浮細胞係為材料,分離得到原生質體,並獲得了再生植株。   植物細胞在去除細胞壁后,能像XX過程那樣相互融合,可實現常規雜交不親和的親本之間進行遺傳物質重組,從而開闢了體細胞雜交的新領域。體細胞雜交已廣泛用於植物育種,已在胞質雄性不育、抗病等方面取得了顯著進展。同時,在木本果樹植物上也得到了有經濟價值的體細胞雜種植株。   目前兩種最有效的融合系統PEG——高pH/Ca2+ 方法和電擊融合方法。   第一例體細胞雜交是通過西紅柿和馬鈴薯的原生質體融合實現的。原生質體融合技術在柑橘種間雜交中得到大量應用。Ohgawary將甜橙的原生質體與飛龍的原生質體融合,得到了體細胞雜種植株。   美國學者Grosser將甜橙的懸浮培養細胞的原生質體與豪殼刺屬的Severinia disticha 愈傷組織的原生質體融合,得到了屬間異源四倍體的體細胞雜種植株。S.distcha 具有抗病、耐寒、耐鹽等優良性狀,適合作柑橘的砧木。

轉化(Transformation)

  分子生物學的飛速發展,導致了植物科學的一場新革命。經過多年的探索,人們從分子水平對生物學和遺傳學有了深刻的認識,與組織培養技術相結合,分子生物學技術已開始應用於植物基因組修飾和改變。   由於基因編碼的同一性,任何有機體內(如病毒、菌類、昆蟲)的有用基因都可以轉入到植物體。由於基因(如抗蟲或抗病基因)的導入,導致了新的基因型的出現或實現基因型的改良,可選育出抗蟲或抗病的基因型。   目前已經分離或應用的目的基因主要有抗植物病蟲害基因、抗非生物脅迫、改良作物產量品質的基因、改變植物其他性狀的基因等。   有關外源基因導入植物細胞的方法有多種,如農桿菌質粒介導法(包括Ti質粒的Ri質粒)、植物病毒載體介導法、DNA直接導入法(包括PEG介導、脂質體介導等化學誘導DNA直接轉化法,電激法、超聲波顯微注XX、激光微束、基因槍法等物理誘導DNA直接轉化法等)和種質系統介導基因轉化法(包括花粉管導入法,XX細胞浸泡法,囊胚、子房注XX法等)。目前最常用且最為有效的方法為根癌農桿菌介導法和基因槍法。自1983年首次用農桿菌介導法在煙草和馬鈴薯上取得成功以來,約有120種植物採用此方法進行轉化。農桿菌介導法對雙子葉植物十分有效,但在單子葉植物中也已開始應用。基因槍法既可以愈傷組織作為受體,又可以懸浮細胞作為受體,並且對單雙子葉植物都十分有效。

細胞工程在動物方面的應用

快速繁殖優良、瀕危品種及新品種

  借腹懷胎提高種畜的利用率。20世紀30年代胚胎移植在綿羊和山羊中取得成功;1982年美國學者獲得世界上第一胎試管牛。通過體外XX、細胞核移植技術胚胎分割、胚胎融合等技術達到快速繁殖的目的,也有可能創造出高產奶牛、瘦肉型豬等新品種。通過胚胎工程克隆技術等進行大熊貓東北虎等珍稀動物的繁殖。

利用動殖物細胞培養生產活性產物、藥品

  主要各種疫苗抗體等。1975年英國劍橋大學利用動物細胞融合技術首次獲得單克隆抗體。已啟用300L和1000L的培養罐分別用於生產單克隆抗體和灰色脊髓炎等疫苗。20世紀90年代國際上興起了一種用活細胞作為治療劑的「活細胞療法」,主要是在體外繁殖患者的自體細胞,使之擴增或具有療效物質,然後再注入到體內,該法對癌症白血病糖尿病燒傷艾滋病等都有潛在的治療效果。

醫學器官修復或移植的組織工程

  運用細胞工程技術使人體殘餘器官的少量正常細胞在體外繁殖,從而獲得患者所需要的、具有相同功能又不存在排斥反應的器官,供器官移植只需。例如,一些骨骼軟骨血管皮膚都正在實驗室培育,肝臟胰臟心臟乳房、手指和耳朵等在實驗室生長成形。

轉基因動物的生物反應器

  與傳統動物細胞培養相比,轉基因動物製藥技術具有很高的效益,一頭轉基因動物就是一座天然的基因藥物製造廠。1992年,上海醫學遺傳所培育攜帶人體蛋白基因的中國首例轉基因試管牛。2000年,我國培育出轉有人α抗胰蛋白酶基因的轉基因山羊,可從轉基因山羊奶中提取治療慢性肺氣腫先天肺纖維化囊腫疾病的特效藥物。

細胞工程在能源、環境保護等領域的應用

  為了獲得能分解利用纖維素水解物,並高效產生乙醇菌株,將利用纖維二糖能力強的Candida abtusa 和產乙醇率高的發酵接合糖酵母進行融合,獲得的融合子不但以纖維二糖為唯一碳源,而且產乙醇能力高於雙親。   綠孢鏈黴菌TTA和西康氏鏈黴菌75viz進行融合,得到4株降解玉米桿纖維素能力比親株高出155%~264% 。   通過電融合法對釀酒酵母和季也蒙假絲酵母進行融合,篩選出既能利用木糖又能利用纖維二糖生產乙醇的菌種,對纖維素再生資源的利用和減少環境污染具有重要意義。   植物組織培養的過程是   脫分化 再分化   離體的組織、器官、或細胞————愈傷組織————胚狀體——植株   在脫分化和再分化的過程中都需要在培養基中添加適當比例生長素細胞分裂素,以誘導細胞的脫分化和再分化。但兩者的比例變化后,誘導的結果是不同的:當生長素含量高於細胞分裂素時,主要誘導植物組織脫分化和根原基的形成(即有利於根的發生);當細胞分裂素含量高於生長素時,則主要誘導植物組織再分化和芽原基的形成(即有利於芽的發生)。