細胞培養

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細胞培養細胞培養技術也叫細胞克隆技術,在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。不論對於整個生物工程技術,還是其中之一的生物克隆技術來說,細胞培養都是一個必不可少的過程,細胞培養本身就是細胞的大規模克隆。細胞培養,既包括微生物細胞的培養,細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化多細胞,這是克隆技術必不可少的環節,而且細胞培養本身就是細胞的克隆。通過細胞培養得到大量的細胞或其代謝產物。因為生物產品都是從細胞得來,所以可以說細胞培養技術是生物技術中最核心、最基礎的技術。

基本概述

  細胞的生長需要一定的營養環境,用於維持細胞生長的營養基質稱為培養基。培養基按其物理狀態可分為液體培養基和固體培養基。液體培養基用於大規模的工業生產以及生理代謝等基本理論的研究工作。液體培養基中加入一定的凝固劑(如瓊脂)或固體培養物(如麩皮、大米等)便成為固體培養基。固體培養基為細胞的生長提供了一個營養及通氣的表面,在這樣一個營養表面上生產的細胞可形成單個菌落。因此,固體培養基在細胞的分離鑒定、計數等方面起著相當重要的作用。從多細胞生物中分離所需要細胞和擴增獲得的細胞以及對細胞進行體外改造,觀察,必須首先解決細胞離體培養問題,同微生物細胞培養的難易相比,比較困難的是來自多細胞生物的單細胞培養,特別是動物細胞的培養。細胞培養泛指所有體外培養,其含義是指從動物活體體內取出組織,于模擬體內生理環境等特定的體內條件下,進行孵育培養,使之生存並生長。細胞培養工作現已廣泛應用於生物學醫學新葯研發等各個領域,成為最重要的基礎科學之一。

設施器材

  設施:超凈台、恆溫培養箱、倒置顯微鏡、液氮儲存罐、電熱鼓風乾燥箱、冰櫃、電子天平、恆溫水浴槽、離心機、壓力蒸汽消毒器。   器材:   一、玻璃器材

無菌

培養皿、滴流瓶、刻讀吸管、離心管、培養瓶、燒杯、量筒、三角燒瓶   二、塑料器材   多孔培養板、培養皿、培養瓶   三、橡皮器材   橡皮製品(最好是硅製品)做各種瓶或試管的塞子、蓋子。   四、金屬器材   剪刀鑷子手術刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號針頭   五、其他物品   紗布、注XX器和針頭

培養基

(一)簡介

  細胞的生長需要一定的營養環境,用於維持細胞生長的營養基質稱為培養基。培養基按其物理狀態可分為液體培養基和固體培養基。液體培養基用於大規模的工業生產以及生理代謝等基本理論的研究工作。液體培養基中加入一定的凝固劑(如瓊脂)或固體培養物(如麩皮、大米等)便成為固體培

培養基

養基。固體培養基為細胞的生長提供了一個營養及通氣的表面,在這樣一個營養表面上生產的細胞可形成單個菌落。因此,固體培養基在細胞的分離、鑒定、計數等方面起著相當重要的作用。從多細胞生物中分離所需要細胞和擴增獲得的細胞以及對細胞進行體外改造,觀察,必須首先解決細胞離體培養問題,同微生物細胞培養的難易相比,比較困難的是來自多細胞生物的單細胞培養,特別是動物細胞的培養。

(二)幾種常用細胞培養基產品

  1. BME(basal medium eagle)基礎伊格培養基   2. MEM   3. DMEM   4. IMDM   5. RPMI-1640   6. M199   7. Mccoy's 5A   8. F10 F12 DMEM混合F12(三)幾種常用細胞培養配套試劑的配置(緩衝液平衡鹽溶液等)

1、無鈣、鎂、離子溶液(1000ml)

  氯化鈉(NaCl)8g磷酸二氫鈉、(NaH2PO4H20)0.05g、氯化鉀(KCl)0.2g、碳酸氫鈉(NaHCO3)1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL   2、PBS(Phosphate-Buffered saline)磷酸鹽緩衝液   甲液:0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液、磷酸氫二鈉(無水)28.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL   乙液:0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鈉(無水)2.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL   甲、乙液于4℃保存使用時按表3-2所示比例,配製成所需pH濃度高壓滅菌后室溫保存。   3、Hanks液(HBSS Hank『s Balanced salt solution)   (1)母液甲(20x)配法   ①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O(A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶於800mL雙蒸水中,前一物質溶后再加后一種。   ②CaCl2(A.R)2.8g溶於100mL雙蒸水中,溶時不斷攪拌(此液應單配,單溶)。   待上述兩溶液中的「溶質」全溶后,將它們混合,再用雙蒸水補至1000mL,向其中加2mL氯仿作為防腐劑,置4℃保存。   (2)母液乙(20×)配法   ①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶於800ml雙蒸水中。   ②0.4%酚紅液0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01N、NaOH11.28mL,直到全部溶解,移入100mL容量瓶中,加水至100mL,過濾,pH為7.4,4℃保存。   待上述各「溶質」完全溶解后,用雙蒸水補至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑,置40℃保存。   3)使用液(1×)配法   取母液甲和母液乙各一份,加雙蒸水18份,分裝后,塞好瓶塞,掛上標誌。以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞),置室溫后4℃保存,可使用幾個月。臨用前,用7.5%NaHCO3調至所需pH。   4、Eagle's液(EBSS Eagle's Balanced salt solution)   是一種在二氧化碳(CO2)環境中短期維持細胞活性的平衡鹽溶液,可用於細胞解離前的清洗、細胞或組織的運輸、細胞計數時稀釋、溶液的配置等。   5、HEPES液   生物緩衝液,化學性質穩定,在PH7.2~7.6範圍內,比NaHCO3緩衝液的緩衝能力更強。   6、NaHCO3緩衝液   常規緩衝體系的一部分,但是不穩定,易受空氣中CO2的含量而改變PH值,影響緩衝效果

細胞培養的一般過程

  一、準備工作   準備工作對開展細胞培養異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,準備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、乾燥與消毒,培養基與其他試劑的配製、分裝及滅菌,無菌室或超凈台的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試,具體內容可參閱有關文獻。   二、取材   在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)後接入培養器血中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用於培養,實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養,分化程度低的組織比分化高的容易培養,腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理,儘快培養,因故不能馬上培養時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。由組織並分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。   三、培養   將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養基。如系細胞培養,一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數,按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養器皿並直接加入培養基。細胞XX培養器皿后,立即放入培養箱中,使細胞儘早XX生長狀態。正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態是否正常,有無污染,培養基的PH是否太酸或太鹼(由酚紅指示劑指示),此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。一般原代培養XX培養後有一段潛伏期(數小時到數十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和遊走。過了潛伏期后細胞XX旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養,將一瓶中的細胞消化懸浮後分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為「一代」。二倍體細胞一般只能傳幾十代,而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。   四、凍存及復甦   為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—-196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞碸或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存于液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。復甦一般採用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然後將細胞轉入培養器皿中進行培養。凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復甦時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

細胞培養的一般條件

  簡言之,即細胞需要什麼就提供什麼,道理是如此,真正能做到這點尚需時日,人們至今對細胞的生命周期控制機理認識不足,癌細胞雖然也來自正常細胞,但至今不知道究竟為什麼癌細胞很難停止已經啟動的有害分裂,儘管如此,人們長期的研究結果表明,離體細胞培養需要的基本條件就是下列細胞生理條件。

(1)溫度

  溫度過低時細胞生長緩慢甚至不生長。利用冷凍保藏細胞可保持細胞的原有分裂分化能力。溫度過高導致細胞死亡。這主要是由酶和蛋白質所需要的最適溫度決定的。多數生物大分子遇到高溫后容易導致空間結構改變或者喪失(變性)。細胞膜遇到高溫后容易變態。在自然界,既有耐高溫的

恆溫培養箱

細胞,也有耐低溫的細胞。在極端情況下生長的生物對付極端環境的機制研究在生物進化和農業、環保、發酵工業中意義重大。

(2)pH

  過酸或過鹼可導致細胞死亡。這主要與蛋白質的變性和細胞膜的結構受損有關。

(3)滲透壓

  細胞內外可溶於水的物質比例和種類決定細胞的膨脹與收縮程度,因為細胞膜是半透膜,只允許對自己有利的物質通過。同一物質在細胞內外的分佈數量不同,當某一種極溶於水的物質在細胞外濃度過大時,有可能導致細胞乾癟死亡,這些物質在細胞內過多時導致細胞過量吸水膨脹。細胞膜調節滲透壓的能力是有限的。

(4)營養物

  營養物和水一起,又叫細胞培養液,培養液中含有細胞增殖和生長所需要的各種物質。營養物包括:N 源、C源,這些物質與提供能量有關;無機鹽維生素激素,這些物質與代謝調節控制有關。細胞培養液的設計一直是細胞離體培養技術的關鍵。理想的細胞培養液可以同時解決細胞離體培養所需要的pH、滲透壓、營養物、調節物質的全部需要。在干細胞分化研究與應用中,關鍵是找到一種使幹細胞分化成為所需細胞和組織的營養液相同的人幹細胞,放在不同的營養液中分化培養出人的各種臟器,這個昔日的夢想已經開始成為現實。植物細胞的組織培養技術已經基本完善配套。名貴花卉中草藥脫毒馬鈴薯、組織培養蓮菜苗等植物細胞與組織培養技術的不斷完善,特別是由於組織培養液的商品化已經被廣大農民普遍接受

(5)水

  水是細胞需要數量最大的物質,不同的物種、不同部位、不同生長期的細胞含水量差別相當大。乾旱植物細胞的含水量高達90%。水的需求量一般隨同細胞培養液一起考慮。

(6)無菌條件

  體外細胞培養僅僅是對所需的細胞進行培養,但環境中(如空氣)有各種其他微生物,必須對所需細胞進行無雜菌的隔離培養。無菌條件是細胞離體培養最基本的條件。

(7)光

  植物細胞和少數細菌需要利用光進行光合作用。

(8)氣體

  動物細胞需要不斷供給氧氣和排除二氧化碳,植物細胞與此相反。   二氧化碳的作用:調節pH,有緩衝作用,沒有刺激動物細胞呼吸的功能

動物細胞培養的特殊條件

  在所有的細胞離體培養中,最困難的是動物細胞培養。下面是它所需要的特殊條件。   (1)血清:動物細胞離體培養常常需要血清。最常用的是小牛血清。血清提供生長必需因子,如激素、微量元素礦物質脂肪。有一天人們真正學會了配製和血清一樣的培養液,那時血清才可被取代。在這裡,血清等於是動物細胞離體培養的天然營養液。   (2)支持物:大多數動物細胞有貼壁生長的習慣。離體培養常用玻璃,

高速冷凍離心機

塑料等作為支持物。   (3)氣體交換:二氧化碳和氧氣的比例要在細胞培養過程中不斷進行調節,不斷維持所需要的氣體條件,每一次開箱操作后的快速恢復對設備的要求可想而知有多難?由此決定了動物細胞離體培養設備要求高、投資大。

植物細胞培養的特殊條件

  (1)光照:離體培養的植物細胞對光照條件不甚嚴格,因為細胞生長所需要的物質主要是靠培養基供給的。但光照不但與光合作用有關,而且與細胞分化有關,例如光周期可對性細胞分化和開花調控作用,所以以獲得植株為目的的早期植物細胞培養過程中,光照條件特別重要。以植物細胞離體培養方式獲得重要物質,如藥物的過程,植物細胞大多是在反應器中懸浮培養。   (2)激素:植物細胞的分裂和生長特別需要植物激素的調節,促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是最基本的激素。植物細胞的分裂,生長,分化和個體生長周期都有相應的激素參與調節。和動物細胞相比,植物細胞離體培養對激素要求的原理已經了解,其應用技術也已相當成熟,已經有一套廣泛作為商品使用的培養液。同時解決了植物細胞對水、營養物、激素、滲透壓、酸鹼度、微量元素等的需求。

微生物細胞培養的特殊條件

  微生物多為單細胞生物,野生生存條件比較簡單。所以微生物人工培養的條件比動植物細胞簡單得多。其中厭氧微生物培養比好氧微生物複雜,因為嚴格厭氧需要維持二氧化碳等非氧的惰性氣體濃度,而好氧微生物則只需要通過不斷攪拌提供無菌氧氣。微生物對培養條件要求不如動植物細胞那樣苛刻,玉米漿蛋白腖麥芽汁、酵母膏等成為良好的微生物天然培養基。對於一些特殊微生物的營養條件要求,可以在這些天然培養基的基礎上額外添加。

注意事項

  1、實驗進行前,無菌室及無菌操作台(laminarflow)以紫外燈照XX30-60分鐘滅菌,以70%ethanol擦拭無菌操作抬面,並開啟無菌操作颱風扇運轉10分鐘后,才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,將實驗物品帶出工作台,以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作台運轉10分鐘以上后,再進行下一個細胞株之操作。   2、無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利於氣流之流通。實驗用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作台內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作。   3、小心取用無菌之實驗物品,避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,以手夾住瓶蓋並握住瓶身,傾斜約45°角取用,盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。   4、工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對於來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,並選擇適當等級之無菌操作台(至少ClassII)。操作過程中,應避免引起aerosol之產生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,並避免尖銳針頭之傷害等。   5、定期檢測下列項目:5.1CO2鋼瓶之CO2壓力5.2CO2培養箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,每周更換)。5.3.無菌操作台內之airflow壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000小時/HEPA)。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750),定期更換水槽的水   6、粉末培養基配製好后(加了血清),一般在4度盡量不要超過1個月,如在-20度存放時間可長一些,但最好也不要超過3-4個月,可能對於永生化細胞株來說要求不是太高,細胞嬌弱,放置時間不宜過長。   7、開紫外線照XX台的時候,就將培養基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫。這樣40分鐘后,溫度也升上來了。有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱。一定要注意水浴鍋的衛生,有的常年不清洗,裡面很臟,容易在外面瓶身上吸附大量細菌。因此用它的也一定要勤換水。從水浴鍋拿出后,最好找個毛巾擦乾上面的水。

細胞培養的意義

  1.可以進行植物體外XX及 植物胚胎髮育過程研究。   2.可以進行植物生長發育有關的重要基因或影響因素的研究。   3.可以方便地通過實驗手段培育植物新品種。

細胞培養的方式

1、群體培養:

  大量細胞置於同一培養瓶中進行貼壁或懸浮培養。

2、克隆培養:

  挑選單個細胞或單一集落(克隆)于體外進行培養。常用於細胞克隆化(純化),建立細胞株,長期傳代。[1]

細胞培養的優點

  1、能長期傳代,保持活性,便於監控檢測結構功能和生命活動。   2、培養條件可以人為的控制便於研究細胞代謝、物理、化學、生物因素的影響   3、可用於各種觀察和檢測手段研究活細胞的變化(變異、分化)。可從細胞水平開展亞細胞結構和代謝分子的表達。   4、研究範圍和細胞來源廣泛,選擇性廣。   5、不同代次細胞可長期保存,既可開展同代次不同條件和方法研究,又可觀察不同代次的動態變化。   6、耗資少、經濟、成本低、可大量培養,利於   生物製品的生產。

細胞培養的不足

  細胞或組織生長在人工環境中,與體內環境存在差異,細胞或組織的形態或功能會發生不同程度的改變。

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