多克隆抗體

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抗原刺激機體,產生免疫反應,由機體的漿細胞合成並分泌的與抗原有特異性結合能力的一組球蛋白,這就是免疫球蛋白,這種與抗原有特異性結合能力的免疫球蛋白就是抗體

組織結構

  抗原通常是由多個抗原決定簇組成的,由一種抗原決定簇刺激機體,由一個B淋巴細胞接受該抗原所產生的抗體稱之為單克隆抗體(Monclone antibody)。由多種抗原決定簇刺激機體,相應地就產生各種各樣的單克隆抗體,這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體,機體內所產生的抗體就是多克隆抗體;除了抗原決定簇的多樣性以外,同樣一類抗原決定簇,也可刺激機體產生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。   抗原上那部分可以引起機體產生抗體的分子結構,叫做抗原決定簇。一個抗原上可以有好幾個不同的抗原決定簇,因而使機體產生好幾種不同的抗體,最終產生出抗體是漿細胞。只針對一個抗原決定簇起作用的漿細胞群就是一個純系,純系的英文為Clone,音譯就是克隆。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合,就象導彈精確地命中目標一樣。另一方面,即使是同一個抗原決定簇,在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體,形成好幾種單克隆抗體混雜物,稱為多克隆抗體。   多克隆抗體又簡稱多抗。與之相對應的叫單克隆抗體,簡稱單抗。

抗體分類

  抗原通常是由多個抗原決定簇組成的,由一種抗原決定簇刺激機體,由一個B淋巴細胞接受該抗原所產生的抗體稱之為單克隆抗體(Monclone antibody)。由多種抗原決定簇刺激機體,相應地就產生各種各樣的單克隆抗體,這些單克隆抗體混雜在一起就是多克隆抗體,機體內所產生的抗體就是多克隆抗體;除了抗原決定簇的多樣性以外,同樣一類抗原決定簇,也可刺激機體產生IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等五類抗體。多克隆抗體是由異源抗原(大分子抗原、半抗原偶聯物)刺激機體產生免疫反應,有機體漿細胞分泌的一組免疫球蛋白。多克隆抗體由於其可識別多個抗原表位、可引起沉澱反應,製備時間短,成本低的原因廣泛應用於研究和診斷方面。

抗原準備

概述

  可以作為抗原的物質有很多種,一般的科研實驗中,經常使用的抗原有:偶聯多肽、偶聯的小分子或化合物、天然或重組蛋白等等。   對可溶性抗原而言,為了增強其免疫原性或改變免疫反應的類型、節約抗原等目的,常採用加佐劑的方法以刺激機體產生較強的免疫應答

佐劑應用

  1.佐劑的類型 目前實踐中常應用的佐劑有氫氧化鋁膠、明礬、弗氏佐劑脂質體石蠟   油等。也有採用結合桿菌分枝桿菌白喉桿菌以及細小棒狀桿菌等。   ⑴ 弗氏不完全佐劑(incomplete Freund's adjuvant,IFA)   羊毛脂 1 份   石蠟油 5 份   混合高壓滅菌保存。用時加熱融化,冷卻至 50℃左右,加抗原進行乳化處理。   ⑵ 弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)   弗氏不完全佐劑 10ml   卡介苗 10mg~200mg 卡介苗可 100℃10min 滅活處理。   初次免疫時,最好用弗氏完全佐劑,以刺激機體產生較強的免疫反應。再次免疫時,一般不用完全佐劑,而採用弗氏不完全佐劑。但在研究分枝桿菌及相關抗原時,一般不用弗氏完全佐劑,以免卡介苗的干擾。   ⑶ 脂質體:是人工製備的類脂質的小球體,由一個或多個酷似細胞膜的類脂雙分子層組成,這種結構使其能夠攜帶各種親水的、疏水的和兩性物質,他們被包裹在脂質體內部的水相中,或XX類脂雙分子層或吸附、聯接在脂質體的表面,起到明顯的免疫增強作用。   ⑷ 油佐劑 :採用植物油礦物油均可,包括豆油花生油、油菜油等。目前應用最廣的礦物油。 10 號 白油(石蠟油) 100ml   硬脂酸鋁 2g   司本 80 6ml   混合加熱融化,分裝。用時按下列配方進行乳化。   油相 3 份   水相(加 4%吐溫-80) 1 份   先把油相攪拌起來,然後緩慢加入水相乳化。司本是油分散劑,吐溫是水分散劑,均有利於   乳化。

乳化作用

  將抗原與佐劑混合的過程稱為乳化。乳化的方法很多,可採用研缽乳化;可直接在旋渦振蕩器上乳化;可用組織搗碎器乳化。少量時,特別是弗氏佐劑與抗原乳化時,常採用注XX器乳化,用兩個注XX器,一個吸入抗原液,一個吸入佐劑,兩注XX器頭以膠管連接,注意一定紮緊,然後來回抽吸。當大量乳化時,可採用膠體磨進行。   乳化好的標誌是取一滴乳化劑滴入水中呈現球形而不分散。如出現平展擴散即為未乳化好。乳化過的物質放置一段時間(在保存期內)出現油水分層也是未乳化好的表現。 根據抗原的性質、免疫原性和動物的免疫反應性來決定免疫途徑、免疫次數和間隔時間等。 免疫途徑包括皮下注XX、皮內注XX、肌肉注XX、靜脈注XX、腹腔注XX以及淋巴結內注XX等。抗原量少,則一般多採用加佐劑,淋巴結內或淋巴結周圍、或足掌、或皮內、皮下多點注XX,如抗原量多,則可採用皮下、肌肉、以至靜脈注XX。 注XX間隔時間 帶佐劑的皮內、皮下注XX,一般為間隔 2~4 周免疫一次。不帶佐劑的皮下或肌肉注XX,一般為 1~2 周間隔時間;肌肉或靜脈免疫的,可 5 天左右的間隔時間。 可以把各種注XX途徑聯合起來應用,最終以達到效價要求為目的。

免疫動物

  供免疫用的動物主要是哺乳動物和禽類,常選擇家兔、綿羊、山羊、馬、騾和豚鼠小鼠等。動物的選擇常根據抗體的用途和量來決定,也與抗原的性質有關。如要獲得大量的抗體,多採用大動物;如要是獲得直接標記診斷的抗體,則直接採用本動物;如要獲得間接的標記診斷用抗體,則必須用異源動物製備抗體;如果難以獲得的抗原,且抗體的需要量少,則可以採用純系小鼠製備;一般實驗室採用的抗體,多用兔和羊製備。   免疫用的動物最好選擇適齡的健康雄性動物,雌性動物特別是妊娠動物用於製備免疫抗體則非常不合適,有時甚至不產生抗體。由於對免疫應答的個別差異,免疫時應同時選用數只動物進行免疫。 抗原是多種多樣的,而且千差萬別。就其化學成分而言,有蛋白質抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。就抗原性而言,有完全抗原不完全抗原。為了獲得較好的血清最好是選用蛋白質抗原,如要製備用於篩選細菌表達的 cDNA 文庫或免疫印跡的抗血清,最好選用可降解的蛋白質抗原。不同的抗原,其免疫原性的強弱均不相同,這種免疫原性的強弱取決於抗原的分子量、化學活性基團、立體結構、物理形狀和彌散速度等。   抗原的免疫劑量是依照給予動物的種類、免疫周期以及所要求的抗體特性等不同而不同。劑量過低,不能引起足夠強的免疫刺激,免疫劑量過多,有可能引起免疫耐受。在一定的範圍內,抗體的效價是隨注XX劑量的增加而增高。蛋白質抗原的免疫劑量比多糖類抗原寬。一般而言,小鼠的首次免疫劑量為 50μg~400μg/次, 大鼠為100μg~1 000μg/次, 兔為 200μg~1 000μg/2次。加強劑量為首次劑量的 1/5~2/5。   免疫劑量與注XX途徑有關,一般而言,靜脈注XX劑量大於皮下注XX,而皮下注XX又比掌內和跖內皮下注XX劑量大,也可採用淋巴結內注XX法。加佐劑比不加佐劑的注XX劑量要小,對家兔而言,採用弗氏完全佐劑,則需注XX 0.5mg~1mg/kg./次,如採用弗氏不完全佐劑則注XX劑量應大10 倍以上。如要製備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法。如需要獲得高效價的抗血清,宜採用大劑量長程免疫法。免疫周期長者,可少量多次。免疫周期短者,應大量少次。 兩次注XX的間隔時間應長短適宜,太短起不到再次反應的效果太長則失去了前一次激發的敏感作用。一般間隔時間應為 5~7 天,加佐劑者應為 2 周左右。 注XX的 Ig 純度高,則一般不易引起過敏反應,如注XX血清,即使是少量,在再次免疫時,極易引起過敏反應,所以一定要採取措施。

抗體鑒定

  抗體的效價鑒定 不管是用於診斷還是用於治療,製備抗體的目的都是要求較高效價。不同的抗原製備的抗體,要求的效價不一。鑒定效價的方法很多,包括有試管凝集反應瓊脂擴散試驗、酶聯免疫吸附試驗9ELISA)等。常用的抗原所製備的抗體一般都有約成的鑒定效價的方法,以資比較。如製備抗抗體的效價,一般就採用瓊脂擴散試驗來鑒定。   抗體的特異性鑒定 抗體的特異性是指與相應抗原或近似抗原物質的識別能力。抗體的特異性高,它的識別能力就強。衡量特異性通常以交叉反應率來表示。交叉反應率可用競爭抑制試驗測定。以不同濃度抗原和近似抗原分別做競爭抑制曲線,計算各自的結合率,求出各自在 IC50時的濃度,並按下列公式計算交叉反應率。 如果所用抗原濃度IC50濃度為pg/管,而一些近似抗原物質的IC50濃度幾乎是無窮大時,表示 這一抗血清與其他抗原物質的交叉反應率近似為 0,即該血清的特異性較好。   抗體的親和力 是指抗體和抗原結合的牢固程度。親和力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結合位點與抗原決定簇之間立體構型的合適度決定的。有助於維持抗原抗體複合物穩定的分子間力有氫鍵、疏水鍵、側鏈相反電荷基因的庫侖力、范德華力和空間斥力。親和力常以親和常數K表示,K的單位是L/mol,通常K的範圍在 108 ~1010 /mol,也有多達 1014 /mol。抗體親和力的測定對抗體的篩選,確定抗體的用途,驗證抗體的均一性等均有重要意義。

抗血清凍存

  抗血清收穫后,加 1/萬硫柳汞或 1/萬的疊氮鈉防腐,或加入等量的中性甘油,分裝小瓶,置-20℃以下的低溫保存,數月至數年內抗體效價無明顯變化。注意避免反覆凍融。也可將抗血   清冷凍乾燥后保存。

抗 Ig 抗體製備

  多克隆抗體的製備一般包括以下幾個步驟:   1、製備抗原。   2、選擇實驗動物。   3、動物免疫。   4、試取血進行測試,看看是否成功免疫。   5、如果成功免疫,殺死實驗動物,採集全部血清。   6、純化出抗體。   7、鑒定抗體。包括純度以及特異性。   具體操作與製備原理參見中國免疫學實驗網。   (一)抗原製備   Ig 是免疫球蛋白,對異種動物而言,是良好的抗原物質。可以刺激異種動物產生抗 Ig 血清,   經適當提取后,產生抗 Ig 抗體,又叫第二抗體或抗抗體。在多數的間接標記反應中,均需製備   抗 Ig 抗體。   (二)材料與試劑   1.提取的動物 Ig   2.弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑   3.青黴素鏈黴素   4.實驗動物 兔   5.其它材料及試劑

操作方法

免疫方法

  可以採用以下各種方法之一進行免疫。   (1)淋巴結注XX法:①在兔的兩後足跖部皮下(或皮內)注XX活卡介苗 50mg(每側約0.30ml) 。7~10 天後,兔跖及腘肌淋巴結腫大;②于腫大的兩側淋巴結內各注XX加有完全佐劑的IgG 乳化抗原 0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青黴素 1 000U/ml、鏈黴素 1 000μg/ml);③必要時,14 天後,重複步驟②一次;④再過 7 天後,于兩側淋巴結內各注XX加有完全佐劑的 IgG 乳化抗原0.50ml(含IgG5mg/ml、青黴素 1 000U/ml、鏈黴素 1 000μg/ml) ;⑤5~7天後,耳靜脈采血。測定血清效價。   (2)皮下多點注XX法:①家兔兩側掌(跖內各注XX含有完全佐劑抗原 0.10ml(IgG 含量5mg/ml) ;②7~10 天後,脊柱兩側多點(頸、胸、腰椎各兩點、共 6 點)皮下注XX含不完全佐劑5的抗原,每點 0.50ml;③7~10 天後,脊柱兩側重複注XX一次;④7~10 天後試血。不合格者重複步驟③。   (3)多途徑聯合注XX法:①兩側掌(跖)內側皮下注XX含完全佐劑抗原 0.50ml(IgG 量為 5mg/ml) ;②14 天後,多點皮下注XX含有不完全佐劑抗原;③7 天後,耳靜脈注XX不含佐劑的抗原 2ml;④測定血清抗體效價,不合格者重複步驟③,並適當遞增 IgG 量。

效價測定

  採用瓊脂擴散法。   ⑴ 將血清倍比稀釋,加入外周孔。   ⑵ 中間孔加動物 Ig。   ⑶ 37℃濕盒瓊擴 24 小時,觀察結果。

結果判定

  1.抗 Ig 的效價測定 瓊脂擴散效價達 1﹕16 或 1﹕32 者為合格。   2.純度鑒定 採用瓊擴法。中間孔加抗 Ig 血清,外周孔加 Ig 和標準品 Ig。在抗 Ig 與 I抗原上那部分可以引起機體產生抗體的分子結構,叫做抗原決定簇。一個抗原上可以有好幾個不同的抗原決定簇,因而使機體產生好幾種不同的抗體,最終產生出抗體是漿細胞。只針對一個抗原決定簇起作用的漿細胞群就是一個純系,純系的英文為Clone,音譯就是克隆。由一種克隆產生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標明確地與單一的特異抗原決定簇結合,就象導彈精確地命中目標一樣。另一方面,即使是同一個抗原決定簇,在機體內也可以由好幾種克隆來產生抗體,形成好幾種單克隆抗體混雜物,稱為多克隆抗體。