膠原纖維

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膠原纖維主要含有膠原蛋白氨基酸有甘氨酸脯氨和脯氨酸等膠原是唯一含羥脯氨酸較多的蛋白質因此測定羥脯氨酸的量能確定組織中膠原的含量膠原蛋白占全身蛋白質的30%聚合成膠原的微原纖維的蛋白質分子稱為原膠原分子 膠原纖維是三種纖維中分佈最廣泛含量最多的一種纖維廣泛分佈于各臟器內在皮膚鞏膜肌腱最為豐富膠原纖維染色主要用於和肌纖維的鑒別

目 錄1簡介

2結構

3膠原蛋白的提純

4膠原蛋白的染色

1簡介

膠原纖維collagenous fiber 在三種纖維中數量最多新鮮時呈白色有光澤故又名白纖維在HE染色切片中呈嗜酸性粗細不等直徑0.5~10um呈波浪形有分支並交織呈網膠原纖維的生化成分為I型膠原蛋白膠原蛋白collagen由成纖維細胞分泌于細胞外聚合成膠原原纖維在再經少量黏合成膠原纖維電鏡下膠原原纖維直徑20~100nm呈明暗交替的周期橫紋橫紋周期約64nm,膠原纖維的韌性大抗拉力強[1]

膠原纖維染成粉紅色束狀其中的原纖維大多看不清

兒童時期骨骼的膠元纖維占的比重較大成骨細胞製造骨質十分活躍因此兒童的骨骼彈性大不易折斷

2結構Ⅰ型膠原的原纖維平行排列成較粗大的束成為光鏡下可見的膠原纖維抗張強度超過鋼筋其三股螺旋由二條α1Ⅰ鏈及一條α2Ⅰ鏈構成每條α鏈約含1050個氨基酸殘基重複的Gly-X-Y序列構成X常為Pro脯氨酸Y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸殘基重複的Gly-X-Y序列使α鏈捲曲為左手螺旋每圈含3個氨基酸殘基三股這樣的螺旋再相互盤繞成右手超螺旋即原膠原

原膠原分子間通過側向共價交聯相互呈階梯式有序排列聚合成直徑50~200nm長150nm至數微米的原纖維在電鏡下可見間隔67nm的橫紋膠原原纖維中的交聯鍵是由側向相鄰的賴氨酸或羥賴氨酸殘基氧化后所產生的兩個醛基間進行縮合而形成的

原膠原共價交聯后成為具有抗張強度的不溶性膠原胚胎新生兒的膠原因缺乏分子間的交聯而易於抽提隨年齡增長交聯日益增多皮膚血管及各種組織變得僵硬成為老化的一個重要特徵

人α1Ⅰ鏈的基因含51個外顯子因而基因轉錄后的拼接十分複雜翻譯出的肽鏈稱為前α鏈其兩端各具有一段不含Gly-X-Y序列的前肽三條前α鏈的C端前肽借二硫鍵形成鏈間交聯使三條前α鏈對齊排列然後從C端向N端形成三股螺旋結構前肽部分則呈非螺旋捲曲帶有前肽的三股螺旋膠原分子稱為前膠原procollagen膠原變性后不能自然復性重新形成三股螺旋結構原因是成熟膠原分子的肽鏈不含前肽故而不能再進行對齊排列

3膠原蛋白的提純探索一個簡要的膠原提純方法比較提取不同來源的膠原蛋白的物理化學特性利用影像法探討膠原纖維體外生長聚合三維構建過程和特徵為生物醫學工程生物材料設計和組織工程替代治療提供基礎方法利用乙酸法和酶的降解法提取豬腳關節韌帶大鼠尾的膠原蛋白用光學顯微鏡定量化分析纖維聚集動力學以及結構特性包括纖維密度方向性融合結果組織和細胞中Ⅰ型膠原蛋白單分子是120kDⅠ型膠原α1Ⅰ以及α2鏈表達在120116kDⅠ型膠原蛋白基質行成的膠原纖維狀結論應用該修飾方法可提出並純化到純的膠原蛋白第一次報道膠原基質成分在體外可形成三維結構並用黑白視野觀察纖維形成特徵陽離子鉀鈉溫度及pH影響纖維的強度和膠原的集結時間

4膠原蛋白的染色膠原纖維在HE染色法被染成粉紅色除此之外它還可以用一些陰離子染料來進行染色如用淡綠可把它們染為綠色用苯胺藍可將其染為藍色在網狀纖維染色中如不加以處理它又可被染為棕黃色常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法在免疫細胞化學染色中膠原纖維由於含的負電荷過多常導致某些非特異性的染色應特別注意

一.Van GiesonV.G染色法

I. 試劑的配製

weigert氏蘇木

A液 蘇木素 1g haematoxylin

無水酒精 100ml

B液 30%三氯化鐵 4ml ferric chloride

蒸餾水 95ml

鹽酸 1ml

IIVan Gieson氏液

A液 酸性品紅 1gacid fuchsin

蒸餾水  100ml

B液 苦味酸飽和水溶液1.22%picric acid

注意事項

1Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合幾個小時內用完最長不得超過一天

2蘇木素配后經二十多天才能成熟必須提前配製

3該液能抵抗弱酸性染液對已著染的細胞核在酸性染液的作用不易被脫去顏色如果不特別深染則無須分化

4Van Gieson氏液取B液9ml加入A液1ml即可使用

操作方法後面的各種方法如沒特別說明都在室溫下進行

1切片脫蠟至水

2用Weigert氏蘇木素染20min

3水洗必要時可分化

4流水沖洗10min

5染Van Gieson氏液1min

6用95%酒精快速分化

7無水酒精脫水二甲苯透明封固

結果

膠原纖維鮮紅色肌纖維 黃色紅細胞 黃色細胞核 藍黑或灰色

注意事項

1該法染完的切片較易褪色如需照相應儘早完成

2蘇木素染液如為棕色或沉澱應將其拋棄

3分化用的酒精應使用95%以上的酒精低濃度的酒精褪色能力強容易將著染的紅色脫去

4切片也可以用天青蘭蘇木素替代Weigert氏蘇木素染核效果基本一樣

二.Masson氏三色染色法天青石藍液的配製天青石藍Celestin blue B 1.25g 硫酸鐵銨ferric ammonium sulfate1.25g

蒸餾水 200ml

甘油glycerin 30ml

將前兩者溶於蒸餾水中然後煮沸冷卻過濾再加入甘油和麝香草酚

Mayer氏蘇木素的配製蘇木素 0.1g 蒸餾水 100ml

鉀明礬Potassium alum 5g

檸檬酸Citric acid 0.1g

水合氯醛Chloral hydrate20mg

配製法

將蘇木素放入蒸餾水中用玻棒不停地攪拌直至完全溶解再依次加入鉀明礬檸檬酸和水合氯醛再繼續攪拌最後加入碘酸鈉攪拌均勻即可使用

麗春紅酸性品紅液的配製 麗春紅ponceau 2R 0.7g

酸性品紅acid fuchsin0.3g

醋酸 1ml

蒸餾水 99ml

操作方法 1

切片脫蠟至水 21%高錳酸鉀氧化切片5min

3水洗草酸漂白1min

4水洗蒸餾水洗天青石藍染5min水洗

5摔去余液不用水洗滴染Mayer氏蘇木素3-5min

6流水沖洗5-10min

7麗春紅苦味酸飽和液染5min

81%醋酸水溶液洗

91%磷鉬酸分化切片約5min

10蒸餾水洗

111%淡綠或者甲苯胺藍滴染30s

121%醋酸水溶液洗切片

1395%酒精分化無水酒精脫水

14二甲苯透明中性樹膠封固

結果 膠原纖維呈現綠色或藍色細胞核呈現灰黑或灰藍色肌肉和胞質紅細胞呈現紅色

注意事項①Masson氏染液配完后保存時間不宜過長如有可能每次染色以染配為佳如何可使著色顏色的鮮艷性②切片在各級酒精中脫水時間不宜過長否則會將著染的顏色脫去③切片保存所著染的顏色顯長為12年以後會隨著時間的延長而逐漸褪去應予注意④磷鉬酸和磷鎢酸在染色法中的作用各有不同磷鉬酸作用於膠原纖維磷鎢酸作用於纖維膠]質肌膠質神經膠質和上皮纖維等上述兩種試劑的使用可以促進組織有選擇的染色它們可以減少背景和核的染色使背景清晰⑤ 如有可能在組織固定時用Zenker氏固定液固定如此對染色效果將更好

臨床應用 1

澱粉樣物的區別 膠原纖維發生病變如壞死透明變性時它與澱粉樣物在HE染色時被染為粉紅色不好區別應用V.G染色法能將膠原纖維染為粉紅色而澱粉樣物將被染為黃色 2應用與間胚葉來源腫瘤的區別

纖維瘤肉瘤平滑肌橫紋肌瘤肉瘤神經纖維瘤肉瘤惡性纖維組織細胞瘤等由於都含有大量的纖維HE染色均為紅色應用Masson氏染色法可將膠原纖維染色藍色或綠色肌源性組織被染為紅色

3應用與其他慢性炎症的區別

慢性闌尾炎疤痕愈合時纖維愈復病灶可被染為鮮紅色或藍綠色SARS病患者愈合後有的肺部可出現疤痕粘連此時可顯示藍色或綠色

可用於鑒定肝硬化創傷組織的修復程度肝硬化時的肝組織有許多不同大小的假小葉用上述方法顯示時可顯示出不同的組織結構V.G法可將包繞假小葉的膠原纖維染成紅色膽汗呈綠色

小結

膠原纖維在上述的兩種方法中著染不同的顏色如V.G著染紅色Masson氏著染藍色或綠色這主要取決於染料對組織的滲透吸附沉澱和反應而染料分子量的大小是關鍵分子量小的分子移動迅速行動快對組織的滲透性較強能穿透較為緻密的組織分子量大的染料分子移動較遲緩滲透力較弱可作用於組織強求構較疏鬆的組織染色時間可適當延長

在相關的染料中分子量從小到大依次排列是苦味酸黃色229.11桔黃G黃色452麗春紅紅色480.42酸性品紅紅色585.53苯胺藍藍色737.72亮綠綠色792.72甲基藍藍色>99

染色是一個較為複雜的化學反應和物理作用的雙重過程在應用這些方法時根據不同情況選擇不同的方法認真地操作方能獲得最佳的效果

參考資料 1. 纖維 .組織學胚胎學 [引用日期2012-09-7] .

相關文獻膠原纖維負載鈦對氟鈾廢水中鈾的吸附特性-化工學報-2011年 第2期 (62)

膠原纖維負載鋯對廢水中氟的去除-化學與生物工程-2011年 第10期 (28)

膠原纖維負載鐵Fe(Ⅲ)催化劑對鄰苯二甲酸二甲酯的光助催化降解特性-化工學報-2011年 第12期 (62)

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參考資料

1簡介2結構3膠原蛋白的提純4膠原蛋白的染色

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1簡介

膠原纖維collagenous fiber 在三種纖維中數量最多新鮮時呈白色有光澤故又名白纖維在HE染色切片中呈嗜酸性粗細不等直徑0.5~10um呈波浪形有分支並交織呈網膠原纖維的生化成分為I型膠原蛋白膠原蛋白collagen由成纖維細胞分泌于細胞外聚合成膠原原纖維在再經少量黏合成膠原纖維電鏡下膠原原纖維直徑20~100nm呈明暗交替的周期性橫紋橫紋周期約64nm,膠原纖維的韌性大抗拉力強[1]

膠原纖維染成粉紅色束狀其中的原纖維大多看不清

兒童時期骨骼的膠元纖維占的比重較大成骨細胞製造骨質十分活躍因此兒童的骨骼彈性大不易折斷

2結構Ⅰ型膠原的原纖維平行排列成較粗大的束成為光鏡下可見的膠原纖維抗張強度超過鋼筋其三股螺旋由二條α1Ⅰ鏈及一條α2Ⅰ鏈構成每條α鏈約含1050個氨基酸殘基由重複的Gly-X-Y序列構成X常為Pro脯氨酸Y常為羥脯氨酸或羥賴氨酸殘基重複的Gly-X-Y序列使α鏈捲曲為左手螺旋每圈含3個氨基酸殘基三股這樣的螺旋再相互盤繞成右手超螺旋即原膠原

原膠原分子間通過側向共價交聯相互呈階梯式有序排列聚合成直徑50~200nm長150nm至數微米的原纖維在電鏡下可見間隔67nm的橫紋膠原原纖維中的交聯鍵是由側向相鄰的賴氨酸或羥賴氨酸殘基氧化后所產生的兩個醛基間進行縮合而形成的

原膠原共價交聯后成為具有抗張強度的不溶性膠原胚胎及新生兒的膠原因缺乏分子間的交聯而易於抽提隨年齡增長交聯日益增多皮膚血管及各種組織變得僵硬成為老化的一個重要特徵

人α1Ⅰ鏈的基因含51個外顯子因而基因轉錄后的拼接十分複雜翻譯出的肽鏈稱為前α鏈其兩端各具有一段不含Gly-X-Y序列的前肽三條前α鏈的C端前肽借二硫鍵形成鏈間交聯使三條前α鏈對齊排列然後從C端向N端形成三股螺旋結構前肽部分則呈非螺旋捲曲帶有前肽的三股螺旋膠原分子稱為前膠原procollagen膠原變性后不能自然復性重新形成三股螺旋結構原因是成熟膠原分子的肽鏈不含前肽故而不能再進行對齊排列

3膠原蛋白的提純探索一個簡要的膠原提純方法比較提取不同來源的膠原蛋白的物理化學特性利用影像法探討膠原纖維體外生長聚合三維構建過程和特徵為生物醫學工程的生物材料設計和組織工程替代治療提供基礎方法利用乙酸法和酶的降解法提取豬腳關節韌帶大鼠尾的膠原蛋白用光學顯微鏡定量化分析纖維聚集動力學以及結構特性包括纖維密度方向性融合結果組織和細胞中Ⅰ型膠原蛋白單分子是120kDⅠ型膠原α1Ⅰ以及α2鏈表達在120116kDⅠ型膠原蛋白基質行成的膠原纖維狀結論應用該修飾方法可提出並純化到純的膠原蛋白第一次報道膠原基質成分在體外可形成三維結構並用黑白視野觀察纖維形成特徵陽離子鉀鈉溫度及pH影響纖維的強度和膠原的集結時間

4膠原蛋白的染色膠原纖維在HE染色法被染成粉紅色除此之外它還可以用一些陰離子的染料來進行染色如用淡綠可把它們染為綠色用甲苯胺藍可將其染為藍色在網狀纖維染色中如不加以處理它又可被染為棕黃色常用的特殊染色法有Van Gieson.Masson和Mallary等方法在免疫細胞化學染色中膠原纖維由於含的負電荷過多常導致某些非特異性的染色應特別注意

一.Van GiesonV.G染色法

I. 試劑的配製

weigert氏蘇木素

A液 蘇木素 1g haematoxylin

無水酒精 100ml

B液 30%三氯化鐵 4ml ferric chloride

蒸餾水 95ml

鹽酸 1ml

IIVan Gieson氏液

A液 酸性品紅 1gacid fuchsin

蒸餾水  100ml

B液 苦味酸飽和水溶液1.22%picric acid

注意事項

1Weigert氏蘇木素臨用前取A液和B液等份混合幾個小時內用完最長不得超過一天

2蘇木素配后經二十多天才能成熟必須提前配製

3該液能抵抗弱酸性染液對已著染的細胞核在酸性染液的作用不易被脫去顏色如果不特別深染則無須分化

4Van Gieson氏液取B液9ml加入A液1ml即可使用

操作方法後面的各種方法如沒特別說明都在室溫下進行

1切片脫蠟至水

2用Weigert氏蘇木素染20min

3水洗必要時可分化

4流水沖洗10min

5染Van Gieson氏液1min

6用95%酒精快速分化

7無水酒精脫水二甲苯透明封固

結果

膠原纖維鮮紅色肌纖維 黃色紅細胞 黃色細胞核 藍黑或灰色

注意事項

1該法染完的切片較易褪色如需照相應儘早完成

2蘇木素染液如為棕色或沉澱應將其拋棄

3分化用的酒精應使用95%以上的酒精低濃度的酒精褪色能力強容易將著染的紅色脫去

4切片也可以用天青蘭蘇木素替代Weigert氏蘇木素染核效果基本一樣

二.Masson氏三色染色法天青石藍液的配製天青石藍Celestin blue B 1.25g 硫酸鐵銨ferric ammonium sulfate1.25g

蒸餾水 200ml

甘油glycerin 30ml

將前兩者溶於蒸餾水中然後煮沸冷卻後過濾再加入甘油和麝香草酚

Mayer氏蘇木素的配製蘇木素 0.1g 蒸餾水 100ml

鉀明礬Potassium alum 5g

檸檬酸Citric acid 0.1g

水合氯醛Chloral hydrate20mg

配製法

將蘇木素放入蒸餾水中用玻棒不停地攪拌直至完全溶解再依次加入鉀明礬檸檬酸和水合氯醛再繼續攪拌最後加入碘酸鈉攪拌均勻即可使用

麗春紅酸性品紅液的配製 麗春紅ponceau 2R 0.7g

酸性品紅acid fuchsin0.3g

冰醋酸 1ml

蒸餾水 99ml

操作方法 1

切片脫蠟至水 21%高錳酸鉀氧化切片5min

3水洗草酸漂白1min

4水洗蒸餾水洗天青石藍染5min水洗

5摔去余液不用水洗滴染Mayer氏蘇木素3-5min

6流水沖洗5-10min

7麗春紅苦味酸飽和液染5min

81%醋酸水溶液洗

91%磷鉬酸分化切片約5min

10蒸餾水洗

111%淡綠或者甲苯胺藍滴染30s

121%醋酸水溶液洗切片

1395%酒精分化無水酒精脫水

14二甲苯透明中性樹膠封固

結果 膠原纖維呈現綠色或藍色細胞核呈現灰黑或灰藍色肌肉和胞質紅細胞呈現紅色

注意事項①Masson氏染液配完后保存時間不宜過長如有可能每次染色以染配為佳如何可使著色顏色的鮮艷性②切片在各級酒精中脫水時間不宜過長否則會將著染的顏色脫去③切片保存所著染的顏色顯長為12年以後會隨著時間的延長而逐漸褪去應予注意④磷鉬酸和磷鎢酸在染色法中的作用各有不同磷鉬酸作用於膠原纖維磷鎢酸作用於纖維膠]質肌膠質神經膠質和上皮纖維等上述兩種試劑的使用可以促進組織有選擇的染色它們可以減少背景和核的染色使背景清晰⑤ 如有可能在組織固定時用Zenker氏固定液固定如此對染色效果將更好

臨床應用 1

與澱粉樣物的區別 膠原纖維發生病變如壞死或透明變性時它與澱粉樣物在HE染色時被染為粉紅色不好區別應用V.G染色法能將膠原纖維染為粉紅色而澱粉樣物將被染為黃色 2應用與間胚葉來源腫瘤的區別

如纖維瘤肉瘤平滑肌橫紋肌瘤肉瘤神經纖維瘤肉瘤惡性纖維組織細胞瘤等由於都含有大量的纖維HE染色均為紅色應用Masson氏染色法可將膠原纖維染色藍色或綠色肌源性組織被染為紅色

3應用與其他慢性炎症的區別

如慢性闌尾炎疤痕愈合時纖維愈復病灶可被染為鮮紅色或藍綠色SARS病患者愈合後有的肺部可出現疤痕粘連此時可顯示藍色或綠色

可用於鑒定肝硬化及創傷組織的修復程度肝硬化時的肝組織有許多不同大小的假小葉用上述方法顯示時可顯示出不同的組織結構V.G法可將包繞假小葉的膠原纖維染成紅色膽汗呈綠色

小結

膠原纖維在上述的兩種方法中著染不同的顏色如V.G著染紅色Masson氏著染藍色或綠色這主要取決於染料對組織的滲透吸附沉澱和反應而染料分子量的大小是關鍵分子量小的分子移動迅速行動快對組織的滲透性較強能穿透較為緻密的組織分子量大的染料分子移動較遲緩滲透力較弱可作用於組織強求構較疏鬆的組織染色時間可適當延長

在相關的染料中分子量從小到大依次排列是苦味酸黃色229.11桔黃G黃色452麗春紅紅色480.42酸性品紅紅色585.53苯胺藍藍色737.72亮綠綠色792.72甲基藍藍色>99

染色是一個較為複雜的化學反應和物理作用的雙重過程在應用這些方法時根據不同情況選擇不同的方法認真地操作方能獲得最佳的效果


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